Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparatifs
- Préparez 10 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : 32,27 g d’hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4·12H2O), 4,5 g de dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4·2H2O), 80,0 g de chlorure de sodium (NaCl) ajoutés à de l’eau ultrapure jusqu’à un volume final de 10 L. Conserver la solution à température ambiante (RT).
- Préparez 200 mL de PBS-T : 200 mL de PBS à partir de l’étape 1.1 avec 100 μL de polyoxyéthylène-octylphényléther jusqu’à une concentration finale de 0,05 % (vol : vol). Magasin chez RT.
- Tout en portant des gants et des lunettes de protection, préparer 50 ml de saccharose à 15 % dans une solution de formol neutre tamponnée à 10 % : 7,5 g de saccharose ajoutés à une solution de formol neutre tamponné à 10 % (tableau des matières) jusqu’à un volume final de 50 ml. Magasin sur RT.
prudence: L’inhalation et/ou le contact cutané/oculaire avec le formaldéhyde dans une solution de formol neutre tamponnée à 10 % peuvent être dangereux. Manipulez avec précaution.
- Préparez 1,5 mL de 200 unités/mL de solution mère de colorant conjugué phalloïdine-fluorescent : conjugué de colorant phalloïdine-fluorescent (300 unités dans 1 flacon, solides lyophilisés, longueurs d’onde d’excitation et d’émission : 581 nm et 609 nm, respectivement) en suspension dans 1,5 mL de méthanol. Conservez la solution dans l’obscurité à -20 °C.
- Préparer une solution mère de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 5 mg/mL : 10 mg de DAPI dans 2 mL de N, N-diméthylformamide (DMF). Conservez la solution dans l’obscurité à -20 °C.
- Préparer de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % dans du PBS : 0,5 g de BSA, 10 mL de PBS. Conserver à 4 °C.
- Retirez l’extrémité biseautée d’une aiguille droite de calibre 18 à l’aide d’une pince et pincez l’extrémité pincée avec une pince dans le sens de la longueur pour permettre au liquide de s’écouler à travers la lumière de l’aiguille (Figure 1A1).
note: Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Dissection animale et isolement du jéjunum
- Fixation par perfusion d’une souris
- Portez des gants et travaillez dans un endroit bien ventilé.
- Préparez un bécher en verre de 100 ml, une solution de formol neutre tamponnée à 10 %, des outils chirurgicaux (ciseaux, pinces), un plateau métallique, des sutures en nylon 6-0, une aiguille droite de calibre 18 préparée comme dans la pièce 1.7, une aiguille ailée de calibre 22, une seringue de 20 ml.
- Chargez 20 ml de solution de formol neutre tamponnée à 10 % du bécher en verre dans la seringue de 20 ml et fixez l’aiguille à ailettes de calibre 22 à la sortie.
- Préparez la gélatine liquide en ajoutant 1 g de poudre de gélatine à 20 ml de PBS (gélatine finale à 5 %) dans un tube à centrifuger de 50 ml. Après un trempage à RT pendant 15 min, incuber à 50 °C dans un bain-marie pendant 15 min sans secouer.
- Agiter brièvement et incuber à 50 °C pendant 15 minutes supplémentaires pour dissoudre complètement la gélatine. Laissez le tube à RT jusqu’à utilisation.
- Euthanasier une souris adulte par luxation cervicale.
- Placez la souris de l’étape 2.1.6 sur un plateau métallique et faites une petite incision sur la peau à travers le cartilage ensiforme à l’aide d’outils chirurgicaux.
- Élargissez l’incision avec les deux mains pour exposer les régions thoracique et abdominale.
- Ouvrez le péritoine pour exposer le diaphragme, puis ouvrez le diaphragme des deux côtés.
- Coupez la cage thoracique le long des lignes axillaires antérieures des deux côtés, puis retirez la paroi thoracique en coupant dans une direction transversale à la position du thymus pour exposer le cœur.
- Faites une petite incision sur le pavillon de l’oreillette droite pour drainer le sang et insérez une aiguille ailée de calibre 22 dans l’apex du ventricule gauche. Poussez le piston pour perfuser les tissus avec une solution de formol neutre tamponnée à 10 %.
- Après avoir exposé les organes du bassin, coupez l’extrémité du rectum de l’anus et séparez les intestins du corps en coupant le mésentère.
- Pour isoler le jéjunum, coupez les intestins à 4 cm de la face anale de l’antre gastrique. Jetez la moitié anale de l’intestin grêle restant.
- Coupez le jéjunum en deux pour faciliter la procédure de rinçage. Chargez 20 ml de solution de formol neutre tamponnée à 10 % dans la seringue de 20 ml et fixez l’aiguille droite de calibre 18 préparée à l’étape 1.7 à la sortie.
- Injectez une solution de formol neutre tamponnée à 10 % à partir d’une extrémité du jéjunum coupé pour évacuer le contenu intestinal et fixer la surface de la lumière intestinale (Figure 1A2).
- Lavez la lumière intestinale en injectant du PBS comme décrit à l’étape 2.1.15.
- Rincez la gélatine liquide dans la lumière intestinale comme décrit à l’étape 2.1.15 pour remplacer le PBS par de la gélatine liquide.
- Fermez une extrémité du jéjunum coupé par ligature de suture à l’aide d’une suture coupée en nylon 6-0, remplissez le jéjunum de gélatine liquide et fermez l’extrémité opposée par ligature de suture (Figure 1A3).
- Ajoutez quatre nœuds de suture pour adapter une section de jéjunum en forme de saucisse à la partie déprimée d’un cryomoule (Figure 1A4).
note: Pour les cryomoules avec une section déprimée de 20 mm x 25 mm x 5 mm, une section de jéjunum de ~20 mm est préférable.
- Faire tremper les mouchoirs dans 50 ml de saccharose à 15 % dans une solution de formol neutre tamponnée à 10 % pendant une nuit à 4 °C.
note: Ces étapes assurent la cryoprotection par fixation du saccharose et des protéines par le formol de la gélatine et des tissus. La gélatine gélatinisée au formol ne fond pas à la RT, tandis que la gélatine gélatinisée non fixée à 4 °C fond à la RT.
3. Congélation instantanée de tissus de jéjunum remplis de gélatine
- En coupant le jéjunum au niveau des nœuds de suture, on obtient trois morceaux de jéjunum en forme de saucisse avec les deux extrémités ligaturées (Figure 1A4). Alignez les morceaux ressemblant à des saucisses dans un cryomoule pour l’ajout d’un composé d’enrobage pour la préparation d’échantillons de tissus congelés.
- Congelez en un clin d’œil le cryomoule dans de l’isopentane refroidi à l’azote liquide. Stockez les cryomoules à -80 °C
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
4. Immunofluorescence de cellules de touffe à l’aide de cryosections flottantes
- Cryosectionnement
- Réglez la température de la chambre du cryostat (CT) et la température de l’objet (OT) sur -22 °C. Placez le bloc de tissu congelé dans un moule cryogénique dans la chambre du cryostat pendant au moins 15 min.
- Ajouter 3 ml de PBS dans une boîte de culture de 35 mm.
- Retirez le bloc de tissu congelé du cryomoule et coupez-le en deux avec une lame de rasoir pour exposer la section transversale du jéjunum. Montez la moitié du bloc sur un mandrin (un adaptateur de cryostat) pour sectionner le plan de coupe avec la lame de rasoir.
- Sectionnez le jéjunum rempli de gélatine en sections de 30 m d’épaisseur. À l’aide d’une pince congelée, transférez délicatement les sections dans la boîte de culture de 35 mm préparée à l’étape 4.1.2 (figure 2B, à droite).
- Application d’anticorps primaires
- Lavez les sections flottantes dans la boîte de culture de 35 mm 3 fois pendant 5 minutes chacune avec 3 ml de PBS-T en secouant doucement sur un agitateur réciproque (environ 36 fois/min).
- Préparez une solution de récupération d’antigène : 0,3 mL de solution de récupération d’antigène concentrée (Table des matériaux) dans 2,7 mL d’eau ultrapure. Ajouter 3 mL de solution de récupération d’antigène dans la boîte de culture de 35 mm contenant des sections flottantes.
- Fermez le couvercle, scellez l’espace entre le plat et le couvercle à l’aide d’une bande de ruban adhésif et incubez à 50 °C dans un incubateur d’hybridation pendant 3 h sans secouer.
- Retirer le plat de l’incubateur et laisser refroidir à RT pendant 20 min. Après avoir retiré le ruban de vinyle, lavez les sections 3 fois pendant 5 minutes chacune avec 3 ml de PBS-T et secouez doucement.
- Aspirez le PBS-T et ajoutez 5 gouttes de solution de blocage (table des matériaux) sur les sections. Incuber à RT pendant 5 min en secouant doucement.
- Préparez la solution d’anticorps primaires : 495 μL de BSA à 5 % dans du PBS avec 5 μL d’anticorps phospho-Y1798 girdin (pY1798) (Tableau des matériaux). Ajouter 500 μL de solution d’anticorps primaires sur les sections (il n’est pas nécessaire d’éliminer la solution bloquante).
- Placez le plat dans une chambre d’incubation humidifiée et incubez toute la nuit à 4 °C en secouant doucement.
note: L’incubation d’une nuit peut être prolongée jusqu’à trois nuits.
- Application d’anticorps secondaires
- Lavez les sections 3 fois pendant 5 minutes chacune dans 3 mL de PBS-T en secouant doucement.
- Préparer une solution mère de DAPI diluée : 2 μL de solution mère de DAPI (étape 1.5), 998 μL de PBS.
- Fabriquer une solution d’anticorps secondaires : 476 μL de BSA à 5 % dans du PBS, 10,5 μL de solution de DAPI diluée, 12,5 μL de solution mère de colorant fluorescent à la phalloïdine, 1 μL de colorant fluorescent IgG anti-lapin de chèvre (longueur d’onde : excitation 496 nm, émission 520 nm).
- Après avoir aspiré le PBS-T, appliquez la solution d’anticorps secondaire et incubez dans une chambre d’incubation protégée par la lumière à RT pendant 30 minutes en agitant doucement.
- Lavez les sections 3 fois pendant 5 minutes chacune avec 3 ml de PBS-T et secouez doucement.
- Après le lavage final, retirez le PBS-T et remplacez-le par 3 ml de PBS dépourvu de polyoxyéthylène(10) octylphényléther Transférez la parabole dans un microscope stéréoscopique.
- Placez 200 μL de PBS dans une gouttelette au centre d’une lame en verre blanc revêtue de MAS et transférez une section de jéjunum de la boîte dans la gouttelette à l’aide d’une pointe de pipette P200.
- Après avoir ajusté l’alignement de la section sous le microscope stéréoscopique, aspirez tout le PBS restant autour de la section.
- Ajoutez 20 μL de support de montage aqueux et placez une lamelle de recouvrement de 20 x 20 mm sur le support.
- Scellez immédiatement les bords de la lamelle avec un support de montage à base de xylène. Placez la diapositive sur une carte en bois et laissez le support de montage à base de xylène se solidifier à RT pendant 2 à 3 h.
note: Le protocole peut être mis en pause ici. Une fois que le support de montage à base de xylène s’est solidifié, les lames peuvent être stockées pendant 2 à 3 semaines dans une boîte à lames protégée contre la lumière chez RT.
5. Microscopie confocale
- Mettez de l’huile d’immersion sur l’objectif 63X d’un microscope confocal. Tournez la glissière de lamelle vers le bas et placez la diapositive sur la scène.
- Numérisez les images TC acquises aux longueurs d’onde laser 405, 488 et 555 nm et enregistrez les images au format tiff (.tiff).
note: Choisissez un ensemble de filtres de détection adapté aux colorants de fluorescence (c’est-à-dire maxima d’excitation/émission : 358/461 nm, 490/525 et 590/617).
