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Procédé basé sur l’immunofluorescence pour visualiser des cellules de touffe dans des cryosections de jéjunum

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

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Source : Mizutani, Y. et al., Utilisation d’anticorps anti-phospho-girdine pour visualiser des cellules de touffes intestinales dans des cryosections de jéjunum de souris flottantes librement.J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo illustre une méthode basée sur l’immunofluorescence pour visualiser les cellules de touffes intestinales dans des cryosections de jéjunum de souris flottantes. Dans les villosités intestinales, la co-localisation de la fluorescence verte à l’extrémité luminale avec une masse radiculaire rouge étendue indique la présence de cellules touffues.

Protocol

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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparatifs

  1. Préparez 10 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : 32,27 g d’hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4·12H2O), 4,5 g de dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4·2H2O), 80,0 g de chlorure de sodium (NaCl) ajoutés à de l’eau ultrapure jusqu’à un volume final de 10 L. Conserver la solution à température ambiante (RT).
  2. Préparez 200 mL de PBS-T : 200 ....

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Results

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Figure 1 : Remplissage gélatineux des coupes de jéjunum pour la conservation morphologique des cryosections
(A) Photographies de procédures de remplissage intraluminal du jéjunum de souris avec de la gélatine. (A1) La pointe biseautée d’une aiguille droite de calibre 18 a été retirée pour éviter de percer la paroi intestinale. (A2) Une so.......

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Disclosures

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Slc :DDY Souris femelles de 6 semainesChubu Kagaku Shizaisans objet
Phosphate d’hydrogène disodique 12-eau (Na2HPO412H2O)WakoRéférence 196-02835
Le dihydroenphosphate de sodium dihydraté (NaH2PO42H2OWakoRéférence 199-02825
Chlorure de sodium (NaCl)WakoRéférence 199-10665
Triton X-100, polyoxyéthylène(10) octylphénylétherKatayama Chemicalsans objet
saccharoseWakoRéférence 190-00013
Solution de formol neutre tamponnée à 10 %Muto Chemical20215Étape 1.3.
Conjugué colorant fluorescent phalloïdine, phalloïdine Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA12381
méthanolNacalai TesqueRéférence 21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate)ThermoFisher ScientificD1306
N.N-diméthylformamide (DMF)Nacalai TesqueRéférence 13015-75
Albumine sérique bovinesigmaA9647-10G
Aiguille droite en acier inoxydable de calibre 18TerumoNN-1838R
U.S.P. 6-0, 60 cm de suture coupée en nylon, CrownjunKono Seisakushosans objet
Aiguille ailée de calibre 22TerumoSV-22DLK
Seringue TERUMO de 20 mLTerumoSS-20ES
Tube à centrifuger de 50 mLLeRéférence 91050
Tubes à centrifuger Iwaki de 15 mLIwakiRéférence 2325-015
Microtube à essai de 1,5 mLétoileRSV-MTT1.5
Gélatine en poudre, Gelare-blancNitta BiolabRéférence 2809
Composé d’enrobage pour échantillon de tissu congelé, composé O.C.T. 118 mL 12 piècesSakura FineTechRéf. 4583
Cryomoule, CRYO DISH N° 3, 125 pièces, taille du puits 20 x 25 x 5 (mm)Shoei Work'sRéférence 1101-3
IsopentaneNacalai TesqueRéférence 26404-75
Boîte de culture cellulaire Falcon 35 x 10mm Easy-GripCorning353001
Solution concentrée de récupération d’antigène, solution de récupération de la cible pH 9 10xDakoS2367Solution concentrée de récupération d’antigène à l’étape 4.2.2.
Bloc de protéinesDakoX0909Solution de blocage dans 4.2.5.
Anticorps phospho-Y1798 girdin (pY1798)Laboratoires d’immunobiologie (IBL) = Entreprise XRéférence 28143Anticorps Phospho-Y1798 girdin à l’étape 4.2.6.
Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificRéf. A11034
Support de montage aqueux, Prolong Gold Antifade MountantThermoFisher ScientificRéf. P36930
Couvre-lames, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Epaisseur n°1Verre MatsunamiC022221
Entellan Nouveau support de montage à base de xylène pour la microscopieMerck Millipore107961
Verre coulissant revêtu de MAS blancVerre MatsunamiMI-MAS-01
Mappe en bois de type KOShoei Work'sRéférence 99-40007
Huile d’immersion 518 F Sans fluorescence 20 mlZeissRéférence 444960
Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)GilsonF144801, F123600, F123601, F123602
Système de production d’eau ultra-pureAdvantecLe GS-590
Gant en plastique, Gant en nitrile étoileétoileRSU-NGVM
cryostatMicrosystèmes LeicaCM1950
Congélateur, SANYO Ultra LowSanyoMDF-382
Réfrigérateur vitrineCongélateur NihonNC-ME50EC
Bain-marie, Thermominder SDminiN (pour dissoudre la gélatine à 50 °C)TaitecRéférence 0068750-000
Incubateur d’hybridation (pour récupération d’antigènes à 50 °C)TaitecHB-100
Chambre d’incubation pour immunomarquageBiographie de Cosmo10FAIRE
Agitateur réciproque pour l’immunohistochimie (pour la température ambiante)TaitecNR-1
Agitateur réciproque pour l’immunohistochimie (pour 4 C)Tokyo Rika KikaiMMS-3010
Microscope stéréoscopique (pour la manipulation des tissus)OlympeSZ61
Microscope stéréoscopique (pour la figure 1B)Microsystèmes LeicaM165FC
Microscope à fluorescence (pour la figure 3)NikonE800
Microscope confocal à balayage laserZeissLSM700

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