Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Transfection de cellules 293T avec luciférase et récolte de surnageant viral
- Culture de 293 lymphocytes T
- Préparez le milieu en ajoutant les éléments suivants à un litre de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) chacun : 110 ml de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 11 ml de pénicilline-streptomycine.
- Décongeler 5 x 106 cellules 293T et les transférer dans une fiole T175 avec le milieu préparé comme décrit ci-dessus.
- Divisez les cellules 293T au 1:10 tous les 3 jours pendant 6 jours. Ne laissez pas les cellules devenir confluentes à plus de 90 %.
- Transfection de cellules 293T
note: Les quantités de réactifs suivantes sont calculées pour la transfection d’un ballon T175 de cellules 293T. Ajustez en conséquence si plusieurs flacons doivent être transduits.
- Transférez 1,5 mL de milieu dans chacun des deux tubes de 50 mL à l’aide d’une pipette. Dans un tube, ajoutez 10 μg de plasmide VSV-G, 20 μg de Gag/pol et 20 μg de plasmide luciférase de tomate TD rouge scarabée (CBR-TDR) et mélangez. Dans l’autre tube, ajoutez 100 μL de réactif de transfection in vitro d’ADN et mélangez. Incuber les deux tubes à température ambiante (RT) pendant 5 min
note: Tous les plasmides décrits dans ce manuscrit ont été fournis par le Dr Vladimir Ponomarev.
- Transférez le milieu contenant le réactif de transfection in vitro de l’ADN dans le sens de la goutte à goutte dans le tube contenant les plasmides d’ADN (sur environ 30 s) et mélangez doucement à l’aide d’une pipette. Incuber à RT pendant 20 min.
- Au cours de cette incubation de 20 minutes, détachez les cellules 293T en ajoutant 5 à 10 ml de trypsine à 0,05 %. Une fois les cellules détachées, ajouter 10 mL de milieu et centrifuger à 800 x g pendant 5 min. Remettre les cellules en suspension dans 1,5 mL de milieu.
- Ajouter le milieu contenant le réactif de transfection in vitro de l’ADN et les plasmides d’ADN aux cellules 293T et incuber à 37 °C pendant 30 min.
- Transvaser dans une fiole T175 et ajouter 18 mL de milieu. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
- Le lendemain, aspirez soigneusement le support avec une pipette en verre sans détacher les cellules. Remplacer par 18 ml de milieu frais. Incuber à 37 °C pendant la nuit dans un incubateur.
- Récolte du surnageant viral
- Retirez le surnageant viral à l’aide d’une pipette posée sur de la glace. Centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min pour granuler les cellules et les débris.
note: Si la pastille cellulaire est grande, les cellules ont probablement été perturbées du ballon lorsque le surnageant a été retiré. Ces cellules peuvent être plaquées à nouveau dans un nouveau flacon avec un milieu frais.
- Filtrer le surnageant viral à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
- Utilisez immédiatement le surnageant viral. Conservez-le sur de la glace ou à 4 °C jusqu’à 24 h, ou congelez-le à -80 °C pour un stockage à long terme.
2. Expansion et transduction des lymphocytes T humains activés avec la luciférase
- Activation des lymphocytes T humains in vitro
- Lavez les billes en ajoutant 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans un tube stérile de 15 ml, en ajoutant des billes (une bille pour deux cellules T), en les plaçant dans un support magnétique pendant 2 minutes et en aspirant le PBS.
- Préparez le milieu comme décrit à l’étape 1.1.1, puis ajoutez l’IL-2 à une concentration finale de 30 UI/mL et ajoutez les billes lavées. Préparez 2,5 ml de milieu pour deux millions de lymphocytes T à activer.
- Comptez les lymphocytes T (fraîchement purifiés ou précédemment purifiés, congelés, décongelés et lavés) à l’aide d’un hémocytomètre et d’un colorant bleu trypan. Ajouter les lymphocytes T au milieu préparé à l’étape 2.1.2 et retourner doucement le tube pour mélanger. Les lymphocytes T se dilateront au moins 20 fois selon la source et l’état général des cellules. Déterminez le nombre de lymphocytes T à activer en calculant le nombre nécessaire pour traiter les souris et en divisant par 20. Ici, 20 x 106 lymphocytes T par souris ont été utilisés sur la base d’expériences préliminaires.
- Plaque de 2,5 mL de milieu contenant deux millions de lymphocytes T, des billes et (interleukine 2) de l’IL-2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Culture à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2.
- Examinez les lymphocytes T au microscope 20x tous les jours pendant les 3 prochains jours pour déterminer quand transduire avec la luciférase. Les cellules sont prêtes lorsqu’elles s’agglutinent et épuisent le média, le faisant passer du rouge/rose à l’orange clair.
- Préparation des plaques de rétronectine
note: La rétronectine est utilisée pour enrober les plaques utilisées dans la transduction car elle améliore la transduction des gènes.
- Ajouter 2 mL de 20 μg/mL de rétronectine dans du PBS dans un puits d’une plaque à 6 puits non traitée. Incuber pendant 2 h à RT ou 1 h à 37 °C. Un puits recouvert de rétronectine est nécessaire pour que deux millions de lymphocytes T soient transduis.
- Aspirez la rétronectine sans gratter le fond de la plaque.
- Ajouter 3 mL de BSA à 2 % dans du PBS (filtré stérile) par puits dans la plaque à 6 puits. Incuber pendant 30 min à RT.
- Spinoculation
- Aspirez le BSA sans rayer le fond de la plaque.
- Lavez les puits une fois avec 3 ml de PBS par puits. Continuez ou remplacez-le par du PBS frais et laissez la plaque couverte à 4 °C pendant la nuit.
- Ajouter 2 mL de surnageant viral de la luciférase CBR-TDR (recueilli à l’étape 1.3) par puits.
- Centrifugeuse à 1 240 x g pendant 90 min à 32 °C.
- transduction
- Comptez les lymphocytes T.
- Aspirer le surnageant viral sans gratter le fond de la plaque.
- Plaquez deux millions de lymphocytes T par puits dans 6 mL de DMEM contenant 30 UI/mL d’IL-2 humaine.
- Examinez les lymphocytes T tous les jours. Les lymphocytes T sont prêts à être développés lorsqu’ils sont presque confluents, généralement après 2 jours.
- Lorsque les cellules sont presque confluentes, lavez-les doucement du bas de la plaque à l’aide d’une pipette et transférez chaque puits dans une fiole T75 séparée. Ajouter 9 mL de support, pour un total de 15 mL de support par flacon.
- Le lendemain, ajoutez 15 ml de média supplémentaire. Les cellules doivent être prêtes à être injectées dans les souris le lendemain de cet ajout de milieu. Confirmez la réussite de la transduction en effectuant une cytométrie en flux (la construction de la luciférase contient un fluorophore de tomate TD qui est visible dans le canal PE).
3. Greffe de lymphocytes T transduits par la luciférase chez des souris immunodéprimées
- Préparez et comptez les lymphocytes T pour l’injection.
- Retirez les lymphocytes T des fioles et comptez. Les cellules sont prêtes à être injectées lorsqu’elles se sont multipliées par 20 à 30, généralement au 7e jour après l’activation.
- Centrifugez les lymphocytes T à 800 x g pendant 5 min. Mettez-les en suspension dans 2 mL de milieu et retirez les billes à l’aide d’un support magnétique.
- Pour les expériences où les lymphocytes T seront injectés séparément des anticorps bispécifiques, comptez les lymphocytes T et mettez-les en suspension de sorte que la concentration finale soit de 20 millions de lymphocytes T par 100 μL de milieu. Passez à l’étape 3.2. Pour les expériences utilisant des lymphocytes T armés ex vivo (EAT), passez à l’étape 3.1.4.
- Pour les expériences utilisant des lymphocytes T armés ex vivo, comptez les lymphocytes T et séparez-les dans des tubes individuels de 1,5 mL pour chaque groupe, avec 20 millions de cellules par souris. Par exemple, s’il y a trois groupes de cinq souris chacun, préparez trois tubes de 1,5 ml avec 100 millions de lymphocytes T chacun.
- Centrifugez les tubes de 1,5 mL à 800 x g pendant 5 min. Retirez le média avec précaution sans déranger la pastille de lymphocyte T. Mettre en suspension dans un maximum de 50 μL de milieu contenant les anticorps bispécifiques. Incuber à RT pendant 30 min.
note: Pour les besoins des expériences menées dans le cadre de cette étude, des anticorps bispécifiques exclusifs engageant les lymphocytes T IgG-[L]-scFv générés en laboratoire ont été utilisés. Pour l’armement des lymphocytes T, utilisez 5 μg d’anticorps par 20 x 106 lymphocytes T. Des anticorps bispécifiques disponibles dans le commerce pourraient également être utilisés.
- Éliminez l’excès d’anticorps en ajoutant 1 450 μL de milieu dans chaque tube. Centrifugez à 800 x g pendant 5 min, aspirez soigneusement le média et remettez-le en suspension à une concentration de 20 millions de lymphocytes T armés par milieu de 100 μL.
- Injection et greffe chez la souris
- Anesthésier les souris dans une chambre fournissant de l’isoflurane inhalé à 3,5 % (v/v) dans 1 L/min d’oxygène. Les souris sont complètement anesthésiées lorsque le réflexe de retrait de la pédale du membre postérieur a disparu.
REMARQUE : Fournir un support thermique tout au long de la procédure.
- À l’aide d’une aiguille de 26 G, injectez 20 millions de lymphocytes T dans 100 μL de média rétroorbitalement par souris.
- Administrer 1 000 U d’IL-2 recombinante par voie sous-cutanée pour favoriser la survie des lymphocytes T in vivo.
- Administrez les anticorps bispécifiques par voie rétroorbitaire (dans l’œil non utilisé pour l’injection de lymphocytes T) ou par voie intrapéritonéale. Laissez les souris se remettre de l’anesthésie et retourner dans leurs cages.
REMARQUE : Encore une fois, ici, des anticorps exclusifs qui ont été générés en laboratoire ont été utilisés, mais des anticorps disponibles dans le commerce ont pu être utilisés à la place. Dans les expériences ici, 0,3 à 10 μg d’anticorps par souris et par dose ont été administrés. Les anticorps ont été administrés deux fois par semaine pendant 3 à 4 semaines.
4. Imagerie in vivo de souris greffées avec des lymphocytes T transduits par la luciférase
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée le jour de l’imagerie, qui n’est pas nécessairement le même jour que celui où les lymphocytes T et/ou les anticorps sont administrés aux souris. En règle générale, nous effectuons l’imagerie 24 heures après l’administration des lymphocytes T transduits par la luciférase.
- Préparation de la D-luciférine
- Dissoudre 1 g de D-luciférine dans 33,3 mL de PBS stérile (concentration finale : 30 mg/mL).
- Aliquote la D-luciférine dissoute dans 33 tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et maintenez les tubes à -20 °C.
- Le jour de l’imagerie, décongeler suffisamment d’aliquotes de 30 mg/mL de D-luciférine pour le nombre d’animaux à imager. Un tube suffit pour 10 animaux.
REMARQUE : Recongelez la D-luciférine restante après utilisation. La D-luciférine est stable pendant au moins cinq cycles de congélation/décongélation.
- Administration de D-luciférine à des souris
note: Avant d’administrer de la D-luciférine aux souris, ouvrez le logiciel d’imagerie et initialisez le système. Le refroidissement de la caméra peut prendre plusieurs minutes, et cela doit être fait avant que les souris ne soient injectées avec de la D-luciférine pour s’assurer que l’imagerie peut avoir lieu 5 minutes après l’administration du substrat.
- Anesthésie jusqu’à cinq souris dans une chambre fournissant de l’isoflurane inhalé à 3,5 % (v/v) dans 1 L/min d’oxygène. Les souris sont complètement anesthésiées lorsque le réflexe de retrait de la pédale des membres postérieurs a disparu.
- Une fois les souris complètement anesthésiées, administrer 100 μL de D-luciférine à 30 mg/mL par souris (3 mg par souris) par injection rétroorbitaire avec une aiguille de 26 G. Imaginez ce groupe de souris avant d’administrer la D-luciférine au groupe suivant. Placez le groupe suivant de souris dans la chambre d’isoflurane à anesthésier pendant que le groupe précédent est imagé.
- Imagerie des lymphocytes T transduits par la luciférase
- Déplacez les souris anesthésiées dans la chambre étanche à la lumière de l’imageur et continuez à administrer de l’isoflurane à 3 % à 0,5 L/min. Placez les souris sur le côté de manière à ce que le flanc portant la xénogreffe soit orienté vers le haut vers la caméra. Prenez une autre série d’images avec les souris en position couchée pour évaluer la présence de lymphocytes T dans les poumons.
- À l’aide du panneau de configuration d’acquisition, sélectionnez Luminescent, Photographie et Incrustation. Réglez le temps d’exposition sur auto, le binning sur moyen et F/Stop sur 1. Acquérir des images. Après la première image, réglez le temps d’exposition pour qu’il corresponde à celui qui a été calculé automatiquement pour la première image afin que les images suivantes puissent être comparées directement. Il peut être utile de capturer des images avec plusieurs temps d’exposition pour déterminer le temps d’exposition optimal pour obtenir le signal le plus lumineux sans saturation des pixels.
- Retirez les souris de l’isoflurane, retournez-les dans leurs cages et observez-les jusqu’à ce qu’elles soient éveillées et ambulatoires.
- Répétez les étapes de l’étape 4.2.1 jusqu’à ce que tous les groupes aient été imagés.
