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1. Cultures cellulaires et parasitaires
- Cultivez des cellules LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) de l’American Type Culture Collection (CCL-7) dans un flacon de culture cellulaire de25 cm contenant du milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété par 10 % de FBS (sérum de veau fœtal) inactivé par la chaleur et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) à 37 °C dans 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
- Infectez les cellules LLC-MK2 avec Trypanosoma cruzi (souche Y) selon un protocole précédent.
- Prélever le surnageant des cellules infectées par le LLC-MK2 (5 mL) dans un tube à centrifuger conique de culture cellulaire de 15 mL et centrifuger à 500 x g pendant 10 minutes et à 22 °C pour réduire les débris cellulaires. Maintenir le tube pendant 10 minutes à 37 °C pour permettre aux trypomastigotes de nager jusqu’au surnageant.
- Prélever le surnageant dans un nouveau tube conique et centrifuger à 2500 x g pendant 15 minutes à 22 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille contenant les parasites dans un milieu RPMI complet pour déterminer la densité cellulaire en comptant les cellules dans une chambre de Neubauer.
2. Protocole d’immunofluorescence de contrôle
REMARQUE : Une fois fixées, il est possible de stocker des plaques contenant des lamelles à 4 °C dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,2) pendant une semaine. Pour être stockées, il est important que les cellules ne soient pas passées par l’étape de perméabilisation.
- Placez les cellules LLC-MK2 (2 x 104) dans des plaques à 24 puits contenant des lamelles arrondies stérilisées aux rayons ultraviolets (UV) dans un milieu RPMI pendant 16 heures.
- Pour les cellules infectées, ajouter un surnageant contenant T. cruzi (élément 1.4) à chaque puits en proportion (multiplicité de l’infection, MOI 10:1) et laisser agir pendant 6 heures l’infection. Laver cinq fois les lamelles contenant des cellules infectées et non infectées avec une solution de PBS et fixées avec du paraformaldéhyde à 2 % dans 1x PBS (pH 7,2) pendant 10 min à température ambiante (RT).
- Lavez les lamelles trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1x PBS (pH 7,2).
- Perméabiliser les lamelles avec 0,2 % d’IGEPAL CA-630 (octylphénoxypolyéthoxyéthanol) dans 1x PBS (PH 7,2) pendant 10 min à RT.
- Lavez les lamelles trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1x PBS.
- Incuber les lamelles pendant 30 min à RT avec la solution bloquante (albumine sérique bovine à 2 %, BSA dans 1x PBS, pH 7,2).
- Incuber des lamelles pendant 30 min à RT soit avec des anticorps monoclonaux anti-hnRNPA1 (ribonucléoprotéine anti-hétérogène A1) de souris (dilution 1:200), soit avec des anticorps polyclonaux anti-TcFAZ de souris (protéine de zone d’attache du flagelle anti-Trypanosoma cruzi) (dilution 1:100) dilués dans une solution bloquante.
- Lavez les lamelles trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1x PBS.
- Incuber les lamelles pendant 30 min à RT avec des IgG F(ab')2 (H+L) de chèvre anti-souris conjuguées à Alexa Fluor 488 (1:600) et de la phalloïdine conjuguée à Alexa 594 (1:300) pour colorer les filaments d'actine (F-actine) dans la cellule hôte dilués dans la solution bloquante.
- Laver trois fois avec 1x PBS (pH 7,2) pendant 5 min chacune.
- Appliquez une petite quantité de réactif de montage anti-décoloration ProLong Gold avec du milieu 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) sur la surface de la lame.
- À l’aide d’une pince, inclinez doucement la lamelle dans le support de montage pour éviter la formation de bulles. Une fois sec, scellez la lamelle si vous le souhaitez.
3. Protocole d’immunofluorescence à double marquage utilisant des anticorps monoclonaux et polyclonaux élevés chez le même hôte
- Répétez les étapes 2.1 à 2.6 décrites ci-dessus.
- Incuber des lamelles contenant des cellules infectées et non infectées avec un anticorps polyclonal anti-TcFAZ de souris (1:100) dilué dans une solution bloquante pendant 30 min à RT.
- Lavez les lamelles trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1x PBS.
- Incuber les lamelles pendant 30 min à RT avec des IgG F(ab')2 (H+L) anti-souris de chèvre conjuguées à Alexa Fluor 647 (1:600) diluées dans la solution bloquante.
- Lavez les lamelles trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1x PBS.
- Effectuer la deuxième étape de blocage avec les IgG (H+L) anti-souris de lapin AffiniPure diluées (0,12 mg/mL) dans une solution bloquante pendant 30 min à RT.
- Lavez les lamelles trois fois avec 1x PBS (pH 7,2) pendant 5 min chacune. Ensuite, incuber avec un anticorps monoclonal anti-hnRNP A1 IgG2b de souris (1:200) pendant 30 min à RT.
- Lavez les lamelles trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1x PBS.
- Incuber les lamelles pendant 30 min avec un anticorps IgG2b anti-souris de chèvre conjugué à Alexa Fluor 488 (1:600) et à de la phalloïdine conjuguée à Alexa 594 (1:300) diluée dans la solution bloquante.
- Lavez les lamelles trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1x PBS.
- Répétez les étapes 2.8 à 2.10 décrites ci-dessus.