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1. Purification d’anticorps par chromatographie d’affinité à l’aide d’un système automatisé de chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC)
REMARQUE : La procédure suivante peut généralement être appliquée à la plupart des systèmes automatisés. La purification peut être effectuée à température ambiante ou à 4 °C (si le système FPLC est conservé dans une pièce froide). Une série de tests de dépistage peut être effectuée pour identifier les conditions de purification optimales, y compris la matrice de colonne, le tampon de liaison, le tampon d’élution et le pH appropriés pour assurer une récupération maximale de l’anticorps purifié à partir de milieux conditionnés (voir la section Résultats). Les conditions optimales dépendent de la purification de l’anticorps ou de la protéine. Les purifications ont été effectuées sur un système automatisé de FPLC. Les purifications ont été effectuées à température ambiante à l’aide d’une colonne de protéine A de 5 ml.
- Préparez les tampons suivants avec de l’eau ultra-pure et ajustez le pH recommandé, puis filtrez-les à travers un filtre de 0,22 μm.
- Préparez 1 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4 (tampon de liaison) en mélangeant les éléments suivants : 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na2HPO4 et 0,001 M KH2PO4. Ajustez le pH si nécessaire avant de filtrer le tampon.
- Préparez 500 ml de glycine-HCl 0,1 M pH 2,7 (tampon d’élution). Ajustez le pH avant de filtrer le tampon.
- Préparez 50 ml de 1 M Tris pH 9,0 (tampon de neutralisation).
- Assurez-vous que toutes les connexions d’alimentation et de communication du système avec l’ordinateur sont établies. Les appareils doivent être visibles dans le module « Contrôle du système » du logiciel. Assurez-vous que la cellule UV est réglée à une longueur d’onde de 280 nm. En option : Calibrez le pH-mètre s’il est connecté et à utiliser.
- Immergez les tubes d’entrée de A, B et la pompe d’échantillonnage dans de l’eau ultrapure pour laver le système. Purgez les pompes à l’aide d’une seringue s’il y a de l’air dans le tube ou s’il y a suspicion de présence d’air dans le système. Lavez le système à l’eau en le faisant manuellement via le contrôleur du système ou via une méthode automatisée. Observez que la pression, la conductivité, le tracé UV280 et le pH restent constants et que la limite de pression pour la colonne n'est pas dépassée conformément aux spécifications du fabricant.
note: Des anomalies peuvent indiquer une présence d’air ou un blocage dans le système qui doit être corrigé avant de continuer.
- Dans le module de commande du système, démarrez le débit à 1 ml/min manuellement via la pompe A en position de charge (en contournant la boucle d’échantillonnage) ou d’injection (à travers la boucle d’échantillonnage) pour commencer à connecter la colonne. Débranchez le tube du système à l’entrée de la position de la colonne et retirez la butée connectée à l’entrée de la colonne.
- Laissez l’eau s’écouler du tube du système vers le bas sur le dessus de la colonne, puis fixez le tube du système à la colonne. Le fait que l’entrée de la colonne et le raccord d’entrée débordent de gouttes d’eau assure une connexion sans bulles d’air.
- Fixez la sortie de la colonne à la sortie en aval et vérifiez que tous les raccords sont bien fixés. La colonne étant maintenant fixée au système, ne dépassez pas les limites de pression maximale et de débit décrites dans les spécifications de la colonne.
- Colonne de lavage avec 5 volumes de colonne (CV) d’eau. Si nécessaire, poursuivez le lavage de la colonne jusqu’à ce que le traçage UV280 se soit stabilisé.
- Immergez les tubes d’entrée de A dans le tampon de liaison, B dans le tampon d’élution et la pompe d’échantillonnage dans le tampon de liaison pour équilibrer le système dans les tampons corrects. Remplissez les tubes d’entrée avec un tampon à l’aide de PumpWash en mode manuel.
- Dans le module 'Editeur de méthodes' du logiciel, utilisez l'assistant de méthode pour configurer une méthode de chromatographie d'affinité pour la colonne destinée à être utilisée.
note: Les systèmes FPLC automatisés sont livrés avec des méthodes pré-remplies avec les paramètres recommandés (c’est-à-dire le débit et la limite de pression) et exécutent des étapes en fonction de la colonne (fabricant, matrice et taille) sélectionnée pour la purification.
- Utilisez les étapes d’exécution suivantes pour la chromatographie d’affinité de la protéine A :
- Système d’équilibrage avec 5 CV de tampon de liaison et collecte du flux dans le conteneur à déchets.
- Chargez l’échantillon sur la colonne (le volume à charger est spécifié manuellement dans la méthode) et collectez le flux dans un conteneur séparé.
- Système de lavage avec 5 CV de tampon de liaison et collecte du flux dans un récipient séparé.
- Colonne d’élution avec fractionnement isocratique 5 CV à l’aide d’un tampon d’élution et collecte d’échantillons d’anticorps purifiés sous forme de fractions par collecteur de fractions.
- Système d’équilibrage avec 5 CV de tampon de liaison et collecte du flux dans le conteneur à déchets.
- Une fois la méthode configurée, spécifiez le volume de support conditionné à appliquer à la colonne et enregistrez la method.
note: Le volume spécifié dans la méthode doit être inférieur de 5 à 10 ml au volume réel afin d’éviter l’introduction d’air pendant le cycle de l’échantillon. Le volume spécifié utilisé dans ce protocole est de 90 à 120 ml.
- Immergez le tube de la pompe d’échantillonnage dans le récipient contenant le fluide conditionné.
- Préparez un récipient séparé pour recueillir l’échantillon à travers le tube de sortie spécifié.
note: Il est important de collecter le flux dans le cas où une erreur se produit pendant le passage ou si la capacité de liaison de la colonne est dépassée, ce qui nécessite que le flux soit réappliqué sur la colonne ou que la purification soit répétée.
- Préparez les tubes de collecte dans le collecteur de fractions. Ajouter 100 μl de tampon de neutralisation par fraction de volume de 1 ml. Le système FPLC éluera automatiquement les fractions dans les tubes de collecte.
- Dans le module 'System Control' du logiciel, ouvrez la méthode à exécuter.
note: L’exécution de la méthode est lancée dans une série de pages qui incluent la vérification des variables de la méthode, la configuration du collecteur de fractions et la définition du nom du fichier de résultat et de l’emplacement de stockage.
- Cliquez sur DÉMARRER pour lancer l’exécution. Le fonctionnement peut être surveillé dans le module « System Control ».
- À la fin du cycle de purification, vérifiez le chromatogramme résultant dans le module « Évaluation » du logiciel système.
- Combiner toutes les fractions contenant des protéines dans un tube séparé, échanger un tampon et se concentrer dans du PBS à l'aide d'un dispositif de filtration centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 30 kDa. Effectuer les étapes de centrifugation selon les instructions du fabricant.
- Mesurez la concentration d'anticorps à l'aide du dosage de l'acide bicinchoninique (ACB) selon les instructions du fabricant.
- Si un autre cycle de purification doit être effectué, amorcez le tube de la pompe d’échantillonnage dans le tampon de liaison et répétez les étapes 1.9 à 1.14.
- À la fin des cycles de purification, immergez les tubes d’entrée de A, B et la pompe d’échantillonnage dans de l’eau ultrapure et lavez le système et la colonne comme effectué à l’étape 3.
- Immerger les tubes A, B et de la pompe d’échantillonnage dans de l’éthanol à 20 % et répéter la procédure de lavage pour le stockage du système et de la colonne.
- Débranchez la colonne de la sortie en aval et remplacez la butée de colonne, puis débranchez la colonne à l’entrée et remplacez la butée, reconnectez le tube au système. Stockez la colonne à 4 °C.