Une technique de coloration par immunofluorescence pour détecter la neurogenèse de l’hippocampe adulte

Résumé

Source : Ansorg, A., et al. Immunohistochimie et marquage multiple avec des anticorps de la même espèce hôte pour étudier la neurogenèse de l’hippocampe adulte. J. Vis. Exp. (2015)

La vidéo illustre une méthode de coloration par immunofluorescence utilisée pour examiner la neurogenèse dans l’hippocampe adulte. Initialement, une section de cerveau de souris subit un traitement avec des anticorps primaires dirigés contre les protéines marqueurs associées à la neurogenèse dans les cellules progénitrices neuronales. Ensuite, il est marqué avec des anticorps secondaires marqués avec des fluorophores. La section du cerveau est ensuite observée au microscope confocal pour distinguer divers sous-types de cellules progénitrices, en fonction des modèles d’expression de combinaisons distinctes de protéines marqueurs.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des tissus

1. Préparez du formaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate à 0,1 M pH 7,4 la veille de la perfusion. Conserver à 4 °C.
2. Perfuser par voie transcardiale les souris profondément anesthésiées (3,5 % d’isoflurane) via le ventricule gauche avec 10 ml de solution saline glacée tamponnée au phosphate (PBS), puis avec 40 ml de formaldéhyde glacé (débit de 5 ml/min). Disséquez le cerveau et post-fixez dans le même fixateur pendant 24 heures à 4°C.
3. Transvasez consécutivement les cerveaux dans 10 % (24 h à 4 °C) et 30 % de saccharose (jusqu’à ce que le cerveau coule, environ 48 h). Pour la congélation, immergez lentement les cerveaux cryoprotégés dans de l’isopentane à -25 °C jusqu’à ce qu’aucune bulle ne sorte du tissu. Conserver à -80 °C.
4. Découper des coupes coronales de 40 μm d’épaisseur sur un microtome de congélation (température de bloc à -25 à -16 °C). Transférez séquentiellement des sections dans une solution d’antigel contenant les puits d’une plaque de culture cellulaire à 24 puits (voir Figure 1). Conserver à -20 °C.

2. Immunocoloration

REMARQUE : Les sections sont traitées en flottant, généralement en plaques à 6 puits équipées d’une plaque porteuse et d’inserts en maille. Par exception, les blocages, les incubations d’anticorps et les réactions du complexe avidine-biotine (ABC) sont effectués dans des plaques de 12 ou 24 puits sans inserts de maille (0,5 à 1 ml par puits suffit, selon le nombre de tranches à colorer). Au cours de ces étapes, transférez les sections à l’aide d’une brosse fine (rincez à chaque nouvelle solution). Toutes les incubations se font avec une agitation continue (max 150 tr/min).

1. Immunohistochimie (méthode ABC)
   1. Transférez des sections de l’antigel dans une solution saline tris-tamponnée (TBS) et rincez abondamment (une fois O/N à 4 °C, 5 fois à température ambiante [RT] pendant 10 min chacune) pour éliminer complètement l’antigel.
   2. Pour éteindre l’activité de la peroxydase endogène, incuber pendant 30 min dans 1,5 % de H_{2 O2} dans du TBS-Tween 20 (TBS-T). Faites attention aux bouillonnements et replongez les sections si nécessaire. Rincer 3 fois dans du TBS pendant 15 min chacun.
   3. Facultatif : Pendant ce temps, préchauffez une armoire chauffante et 2 N HCl à 37 °C. Pour dénaturer l’ADN, incubez des sections pendant 30 min à 37 °C dans du HCl 2 N. Séparez délicatement les sections à l’aide d’une brosse.
   4. Facultatif : Neutraliser les sections pendant 10 min dans un tampon de borate de 0,1 M pH 8,5, RT. Pendant le transfert, tamponnez brièvement les inserts en maille contenant les sections sur une serviette en papier pour enlever les restes de HCl. Rincer 2 fois dans TBS pendant 15 min chacun.
   5. Incuber dans TBSplus pour perméabiliser le tissu et bloquer les sites de liaison des anticorps non spécifiques pendant 1 heure à RT.
   6. Incuber dans l’anticorps primaire dilué dans TBSplus, H/N à 4 °C. Rincer 3 fois dans du TBS pendant 15 minutes chacune.
   7. Incuber dans un anticorps secondaire biotinylé dilué dans TBSplus pendant 3 heures à RT. Rincer 3 fois dans TBS pendant 15 min chacune. Entre-temps...
   8. Préparer le complexe ABC selon le protocole du fabricant (1 % A + 1 % B en TBS-T). Laisser reposer pendant 30 min à RT avant utilisation. Incuber les sections dans le réactif AB pendant 1 heure à RT. Rincer 3 fois dans du TBS pendant 15 minutes chacune.
   9. Préparez 50 ml de 3,3′-diaminobenzidine (DAB) dans du TBS-T par plaque à 6 ou 12 puits, divisez-la en deux moitiés, et pipetez 4 ml ou 2 ml par puits, respectivement. Transférez des sections dans la solution DAB (ATTENTION ! Le DAB est toxique. Suivre la fiche signalétique fournie par le fournisseur, c’est-à-dire porter une blouse de laboratoire et des gants et utiliser une hotte chimique.
   10. Ajouter 0,5 ml de 1 %_H2O₂ à la solution DAB restante de 25 ml, mélanger et pipeter des volumes équivalents comme ci-dessus à chaque puits pour démarrer la réaction de peroxydase. Incuber pendant 12 min. Rincer 3 fois dans du TBS pendant 15 min chacun.
   11. Monter les sections sur les diapositives dans la gélatine et sécher à l’air libre.
   12. Facultatif : Contre-coloration avant de placer la lamelle.
       note: Si le rapport signal/bruit est faible en raison du bruit de fond élevé, répéter le traitement_H2O₂ après l’incubation avec le réactif AB (étape 2.1.8).
2. Immunofluorescence multiple
   1. Immunofluorescence multiple simple ou simultanée
      1. Transférez les sections de l’antigel dans le TBS et rincez abondamment (une fois O/N à 4 °C, 5 fois à RT pendant 10 min chacune) pour éliminer complètement l’antigel.
      2. Facultatif : comme les étapes 2.1.3 - 2.1.4.
      3. Incuber dans TBSplus pour perméabiliser le tissu et bloquer les sites de liaison des anticorps non spécifiques, 1 heure à RT.
      4. Incuber dans un cocktail d’anticorps primaires (p. ex., α-BrdU de rat (bromodéoxyuridine), α-DCX de cobaye (doublecortine), α-GFP de chèvre (protéine fluorescente verte)) dilué dans TBSplus, H/N à 4 °C. Rincer 3 fois dans du TBS pendant 15 minutes chacune.
      5. Incuber dans un cocktail d’anticorps secondaires conjugués au fluorochrome (p. ex., rouge de rhodamine α-rat, Alexa-647 α-cobaye, Alexa-488 α-chèvre ; tous dérivés chez l’âne) dilués dans TBSplus, 3 heures à RT ou H/N à 4 °C. Protégez désormais les sections de la lumière. Rincer 3 fois dans du TBS pendant 15 min chacun.
      6. Monter les sections sur les diapositives dans de la gélatine et sécher à l’air libre pendant la nuit (non/f). Lamelle avec milieu de montage aqueux.
   2. Immunofluorescence multiple séquentielle avec des anticorps primaires de la même espèce hôte
      1. Comme les étapes 2.2.1.1 à 2.2.1.3.
      2. Incuber dans le premier anticorps primaire (p. ex., α-antigène A de lapin), O/N à 4 °C. Rincer 3 fois dans du TBS et une fois dans du TBS-T pendant 10 min chacun.
      3. Incuber dans le premier anticorps secondaire conjugué au fluorochrome (p. ex., Rhodamine Red-conj., âne α-lapin), 3 h RT. Désormais, protégez les sections de la lumière. Rincer 3 fois au TBS et une fois au TBS-T pendant 10 minutes chacune.
      4. Incuber dans 10 % de sérum normal du même hôte que les anticorps primaires (p. ex., sérum de lapin) pendant 3 heures RT pour saturer les paratopes ouverts du premier anticorps secondaire. Rincer 3 fois au TBS et une fois au TBS-T pendant 10 minutes chacune.
      5. Incuber dans TBSplus avec 50 μg/ml de fragments Fab monovalents non conjugués dirigés contre l’hôte des anticorps primaires (p. ex., IgG α-lapin (H+L)) pour couvrir les épitopes qui pourraient être reconnus par le deuxième anticorps secondaire, O/N à 4 °C.
      6. Rincer au moins 3 fois dans du TBS et une fois dans du TBS-T pendant 10 minutes chacun. Lors du transfert, tamponnez brièvement les inserts en maille contenant les sections sur une serviette en papier pour enlever les restes de Fab.
      7. Incuber dans le deuxième anticorps primaire (p. ex., α-antigène B de lapin), O/N à 4 °C. Rincer 3 fois dans du TBS et une fois dans du TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      8. Incuber dans le deuxième anticorps secondaire conjugué au fluorochrome (p. ex., Alexa-488-conj. âne α-lapin), 3 heures RT. Rincer 3 fois dans du TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus.
         note: Pour marquer des antigènes avec des anticorps provenant d’espèces hôtes différentes, ajoutez-les à l’étape 2.2.2.2 et les anticorps secondaires respectifs à l’étape 2.2.2.3.

Résultats

Graphique 1. Illustration schématique du transfert de tranches de microtome dans une plaque de 24 puits. Commencez par A1 et placez les tranches suivantes dans la rangée A ; après A6, passez à la rangée B suivante, et ainsi de suite. Arrivé à la D6, retournez à la A1 et continuez. Cette disposition des tranches permet de quantifier chaque^nième section d’un cerveau entier. Pour la qu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Préparation des tissus
Isoflurane-Actavis	Piramal Soins de santé	700211
Poudre de paraformaldéhyde (PFA)	Riedel-De Häen	Référence 16005	toxique, inflammable
Pompe à perfusion PD5206	Heidolph Instruments	Référence : 523-52060-00
Tube de laboratoire Masterflex Tygon, Ø 0,8 mm	Thermo Fischer Scientific	Référence 06409-13
Aiguille d’alimentation, droite, 21 G, 1,75 mm pointe olive, 40 mm	Agnthos	N° 1036
Microtome de congélation Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
Plaques multipuits de culture cellulaire à 24 puits	Greiner Bio-One	Référence 662160
Immunohistochimie
Tefal vitacuiseur vapeur	Tefal	VS 4001
Inserts de membrane en maille polyester Netwell 24 mm	Corning	Référence 3479	Préchargé dans des plaques de culture à 6 puits
Empiècements en maille polyester Netwell 15 mm	Corning	Référence 3477	Préchargé dans des plaques de culture à 12 puits
Kit de support 6 puits en plastique Netwell	Corning	Référence 3521	pour inserts de membrane en maille polyester de 24 mm
Kit de support en plastique Netwell à 12 puits	Corning	Référence 3520	pour inserts de membrane en maille polyester de 15 mm
Kit Vectastain Elite ABC	Laboratoires Vecteurs	Réf. PK-6100
DAB (3,3′-diaminobenzidine tétrachlorhydrate de chlorhydrate)	Sigma-Aldrich	D-5637	Cancérigène, sensible à la lumière
Fluoromount-G	SouthernBiotech	Référence 0100-01
Anticorps primaires
lapin IgG1 α-Ki67
lapin α-GFAP, AS-3-GF	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100 ; nécessite la récupération de l’épitope
IgG de chèvre (H+L) α-GFP	Systèmes synaptiques	173 002	09:20
IgG1 de souris α-nestin	Anticorps anti-Acris	R1091P	06:00
cobaye IgG (H+L) α-Doublecortin	Abcam	AB6142	1:200 ; nécessite la récupération de l’épitope
rat IgG2a α-BrdU (ascite)	Merck Millipore	AB2253	09:20
rat IgG2a α-BrdU (purifié)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	pour la détection du BrdU ; DAB 1:500/IF 1:400
souris IgG1κ α-BrdU	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	pour la détection de CldU ; DAB 1:500/IF 1:250-400
souris IgG1 α-NeuN	BD Biosciences	Référence 347580	pour la détection de l’IdU ; DAB 1:500/IF 1:350
Anticorps secondaires	Merck Millipore	MAB377	09:20
âne α-cobaye IgG (H+L)-Biotine
âne α-rat IgG (H+L)-Biotine	Dianova	Tél. : 711-065-152	09:20
âne α-souris IgG (H+L)-Biotine	Dianova	Tél. : 712-065-150	09:20
chèvre α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Dianova	Tél. : 715-065-151	09:20
âne α-chèvre IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Sondes moléculaires	A11006	05:10
âne α-souris IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	Sondes moléculaires	A11055	05:10
âne α-souris IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	Tél. : 715-097-003	02:40
âne α-cochon d’Inde IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	Tél. : 715-605-151	05:10
âne α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	Tél. : 706-605-148	05:10
âne α-lapin IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	Tél. : 712-295-150	05:10
âne α-cochon d’Inde IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	Tél. : 711-295-152	05:10
Streptavidine-Rhodamine Red-X	Dianova	Tél. : 706-296-148	05:10
chèvre α-lapin IgG (H+L)-AMCA	Dianova	Tél. : 016-290-084	09:20
Hoechst 33342	Dianova	Tél. : 111-155-144	1:250, fonctionne uniquement avec rabbit α-GFAP
DAPI	Sondes moléculaires	N° H3570	17 h 40
bloquant	Sondes moléculaires	D1306	17 h 40
Fab-fragment âne α-souris IgG (H+L)
Fab-fragment âne α-lapin IgG (H+L)	Dianova	Référence 715-007-003	01:20
Sérum d’âne normal	Dianova	Référence 711-007-003	01:20
Sérum de lapin normal	Merck Millipore	S30
Sérum de chèvre normal	Dianova	Référence 011-000-010
Albumine sérique bovine	Dianova	Référence 005-000-001
histologie	Sigma-Aldrich	A7906
Violet de crésyle
Néo-clair	Sigma-Aldrich	Réf. C5042
Néo-monture	Merck Millipore	109843	Substitut de xylène non toxique
microscopie	Merck Millipore	109016	Support de montage permanent
Axioskop 2
LSM 710	Microscopie Carl Zeiss
	Microscopie Carl Zeiss