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1. Préparation des animaux
- Anesthésier les souris à l’aide d’isoflurane à 3 %. Ouvrez la poitrine en faisant une incision horizontale dans la région au-dessus du milieu de l’abdomen et en tirant sur la peau. Faites soigneusement une autre incision pour ouvrir la cavité thoracique sans percer d’autres organes.
- Perfuser le cœur par l’apex d’abord, puis le ventricule droit à l’aide de glutaraldéhyde froid à 3 % dans une solution cardioplégique (50 mM de KCl, 5 % de dextrose dans le PBS, voir tableau 1) pendant 2 min pour assurer une relaxation myocardique complète.
- Perfuser le cœur à l’aide de glutaraldéhyde glacé à 3 % dans 0,1 M de tampon de cacodylate de sodium (pH 7,4) pendant encore 2 min. En utilisant la pression par gravité, utilisez une aiguille de 25 G 5/8 po pour introduire les fixateurs dans le cœur. Immédiatement après que le cœur commence à se remplir avec le fixateur, soulevez l’apex du cœur et coupez les vaisseaux en dessous à 1-2 mm du cœur pour soulager la pression et permettre aux liquides de s’écouler.
- Disséquez le cœur, retirez les oreillettes et plongez les ventricules dans du glutaraldéhyde à 3 % / cacodylate de sodium 0,1 M glacé dans une boîte de Pétri. Faites une coupe de papillon après 30-60 min de fixation et placez-la dans une boîte de Pétri contenant 3 % de glutaraldéhyde/cacodylate (voir tableau des matériaux). Hachez le cœur à l’aide d’une lame chirurgicale en petits cubes de 1mm3 pendant qu’il est dans une solution de glutaraldéhyde/cacodylate.
- Fixer/immerger le tissu cardiaque disséqué dans une solution de glutaraldéhyde/cacodylate pendant 24 h à 4 °C.
2. Traitement du tissu cardiaque
- Après 24 h de fixation, laver les tissus dans 0,1 M de tampon de cacodylate de sodium pendant 20 min.
- Préparez un tampon cacodylate de 0,1 M en suivant les étapes ci-dessous.
- Pour préparer un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M, préparez une mère de tampon de cacodylate de sodium de 1 M en dissolvant du cacodylate de sodium (21,4 g) et une solution de chlorure de calcium à 1 % (3 mL) dans 90 mL d’eau distillée. Augmentez le volume de la solution à 100 mL en ajoutant l’eau distillée. Remuez bien la solution et laissez-la toute la nuit pour dissoudre le soluté.
- Ensuite, prélever 10 ml de solution mère de cacodylate de sodium 1 M et l’ajouter à 80 ml d’eau distillée. Ajustez le pH à 7,4 à l’aide de HCl et volumez-le jusqu’à 100 mL en ajoutant de l’eau distillée.
- Répéter le lavage dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M pendant encore 20 min. Retirer les mouchoirs du tampon de cacodylate de sodium et les immerger dans une solution de tétroxyde d’osmium à 2 % pendant 4 h à température ambiante. Ce processus s’appelle l’osmication.
- Préparez une solution de tétroxyde d’osmium à 2 % en suivant les étapes ci-dessous.
- Pour préparer une solution de tétroxyde d’osmium à 2 %, prendre une solution de tétroxyde d’osmium à 4 %, 4 mL (voir le tableau des matières), 1 M de solution mère de cacodylate de sodium (0,8 mL) et de l’eau distillée (3,2 mL) pour obtenir un total de 8 mL de solution.
note: L’ensemble de ce processus et les étapes à partir de maintenant doivent être effectués dans la hotte.
- Après l’osmication, immergez les tissus dans une solution d’acétate de sodium à 2 % pendant 10 min à température ambiante.
- Préparez une solution d’acétate de sodium à 2 % en dissolvant 4 g d’acétate de sodium dans 20 ml d’eau distillée.
- Ensuite, plongez les mouchoirs dans une solution d’acétate d’uranyle à 2 % pendant 1 h à température ambiante.
- Préparez une solution d’acétate d’uranyle à 2 % en dissolvant 4 g d’acétate d’uranyle dans 20 mL d’eau distillée.
- Après la coloration à l’acétate d’uranyle, déshydratez les tissus séquentiellement à travers les alcools gradués et l’acétone dans l’ordre mentionné dans le tableau 2.
3. Intégration du tissu cardiaque
- Incorporez les tissus déshydratés dans de la résine époxy à faible viscosité en suivant les étapes ci-dessous.
- Pour fabriquer une résine époxy à faible viscosité, mélangez 10,24 ml de dioxyde de vinyle cyclohexène monomère époxy, 6,74 ml d’éther diglycidylique de polypropylène glycol (DER 732) et 30,05 ml d’anhydride nonénylsuccinique (NSA) (voir le tableau des matériaux) dans un tube de 50 ml. Remuez bien la suspension à la main pendant 2 min.
- Ajoutez 18 gouttes d’accélérateur époxy 2-diméthylaminoéthanol (DMAE, voir tableau des matériaux) et remuez la suspension pour bien mélanger les composants.
- Imprégnez les tissus de résine époxy dans la séquence de mélange suivante.
- Remplacez la résine 100 % acétone par une suspension de résine 1:1 et plongez les tissus dedans pendant 1 h à température ambiante.
- Remplacez la résine 1:1 : suspension d’acétone par la résine 6:1 : suspension d’acétone et immergez-y les tissus pendant 3 h.
- Enfin, remplacez la suspension résine 6:1 : acétone par une suspension 100 % résine et laissez les tissus immergés dedans toute la nuit à température ambiante.
- Mettez les tissus dans de la résine fraîche dans des micro-moules de 8 mm (voir tableau des matériaux) et durcissez les tissus incrustés à 70 °C pendant la nuit.
note: Assurez-vous que la résine est dure mais pas cassante après le durcissement.
4. Coupe tissulaire à l’aide d’un ultramicrotome
- Coupez les blocs de résine avec le tissu à une longueur maximale de 1 mm avant de les monter sur l’ultramicrotome (voir le tableau des matériaux). Placez le moule aussi précisément que possible dans le bras segmenté de l’ultramicrotome et faites avancer manuellement le moule de l’échantillon vers le couteau diamanté.
- Coupez les sections à une épaisseur de 500 nm (un demi-micron) avec un couteau Histo (voir tableau des matériaux), et à l’aide de l’outil de boucle EM, ramassez-les et placez-les sur une lame de verre.
- Placez la lame de verre sur une plaque chauffante pour coloration bleue toluidine afin de trouver la zone d’intérêt.
- Après avoir trouvé la zone d’intérêt, utilisez un couteau Ultra 45° (voir Tableau des matériaux) pour produire des sections ultraminces en or pâle (100 nm). Placez ces sections ultrafines sur le côté terne d’une grille de cuivre de 200 mailles.
5. Coloration de section de cœur ultramince
- Commencez la coloration en démasquant l’antigène à l’aide d’une solution de gravure, c’est-à-dire une solution de méta-périodate de sodium à 5 %.
- Préparer 500 μL de solution de métaperiodate de sodium à 5 % (voir le tableau des matériaux) dans de l’eau distillée.
note: Préparez la solution fraîche avant utilisation.
- Mettez 20 μL de solution de métaperiodate de sodium sur un film de paraffine propre. Placez les grilles complètement séchées avec des sections de tissu sur la gouttelette de la solution de gravure.
note: Le côté émoussé de la grille avec la section de tissu doit être orienté vers la solution de gravure.
- Laissez la grille de section sur la solution pendant 30 min à température ambiante.
- Lavez la section de tissu gravée en la plaçant sur une gouttelette d’eau distillée pendant 60 s.
- Bloquer les aldéhydes résiduels en plaçant les grilles de section sur une gouttelette de solution de glycine 0,05 M pendant 10 min à température ambiante. Épongez les bords de la grille sur du papier filtre pour éliminer la solution résiduelle de glycine.
- Préparez une solution de glycine 0,05 M (voir le tableau des matières) en dissolvant 3,75 mg de glycine dans 1 mL de 1x PBS (pH 7,4).
- Placer les grilles de section dans 10-20 μL de solution de blocage pendant 25 min à température ambiante.
note: Composition de la solution bloquante : 2 μL de sérum de chèvre normal à 1 % (NGS) + 20 μL de BSA à 1 % (concentration finale : 10 %) + 178 μL de 1x PBS (pH 7,4) pour obtenir un volume final de 200 μL.
- Épongez les bords de la grille sur du papier filtre et placez la section de la grille sur un diluant d’anticorps pour le conditionnement à température ambiante pendant 10 min.
- Incuber les sections de la grille avec l’anticorps primaire (Sigmar1 dans ce cas, voir le tableau des matériaux ; dilué 1:10 dans un diluant d’anticorps) pendant 1 h 30 min dans une chambre humidifiée.
- Séchez la grille par épongement et lavez les sections de la grille avec un diluant d’anticorps deux fois pendant 5 minutes chacune.
- Incuber les sections de la grille avec un anticorps secondaire biotinylé (dans ce cas, un anticorps secondaire polyclonal biotinylé de chèvre anti-lapin, voir le tableau des matériaux ; dilué 1:10 dans un diluant d’anticorps) pendant 1 h dans une chambre humidifiée.
- Séchez la grille par épongement et lavez les sections de la grille avec un diluant d’anticorps deux fois pendant 5 minutes chacune.
- Incuber les sections de grille dans du QD conjugué à la streptavidine disponible dans le commerce (QD655nm, voir le tableau des matériaux ; dilué 1:10 dans un diluant d’anticorps) pendant 1 h dans une chambre humidifiée à température ambiante. Évitez l’exposition à la lumière en recouvrant la chambre d’une feuille d’aluminium.
- Séchez les bords de la grille avec du papier filtre et lavez les sections de la grille en les plaçant sur des gouttelettes d’eau pendant 2 min.
- Épongez les bords de la grille pour les faire sécher.
Tableau 1 : Composition du PBS et d’autres solutions utilisées pour la déshydratation des tissus.
| tampon | composition | quantité |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) (1x) (1 L) | chlorure de sodium | 8 grammes |
| chlorure de potassium | 0,2 g |
| Phosphate de sodium dibasique | 1,44 g |
| Phosphate de potassium monobasique | 0,24 g |
| Ajustez le pH à 7,4 | |
Tableau 2 : Application d’alcool gradué et d’acétone pour la déshydratation des tissus (étape 2.5)
| composant | Heure |
| 50 % d’éthanol | Durée : 10 minutes |
| 70 % d’éthanol | Durée : 10 minutes |
| 95 % éthanol | Durée : 10 minutes |
| 100 % éthanol | Durée : 20 minutes |
| 100 % éthanol | Durée : 20 minutes |
| 100 % acétone | Durée : 30 minutes |
| 100 % acétone | Durée : 30 minutes |