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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des animaux et fixation des reins
- Effectuez la fixation de perfusion en suivant les étapes ci-dessous.
- Anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane (3 %, 2,0 L/min) et administration intrapéritonéale de chlorhydrate de médétomidine (0,3 mg/kg), de tartrate de butorphanol (5 mg/kg) et de midazolam (4 mg/kg) (voir le tableau des matières).
- Perfuser l’animal avec 20 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) et 30 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans un tampon phosphate (PB) à travers le ventricule gauche du cœur.
- Effectuez la fixation par immersion juste après la fixation de perfusion et le prélèvement rénal.
- Immergez le rein dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant 16 h supplémentaires, puis lavez-le avec du PBS pendant 2 h (trois fois)9 (Figure 1).
prudence: Le formaldéhyde et le paraformaldéhyde sont des irritants toxiques. Manipulez les réactifs dans une hotte avec l’équipement de protection individuelle approprié.
2. Décoloration et délipidation
- Préparez CUBIC-L (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) pour la décoloration et la délipidation composé de 10 % en poids de Triton X-100 et de 10 % en poids de N-buthyldiéthanolamine (voir le tableau des matériaux), conformément aux rapports précédemment publiés.
- Effectuez la décoloration et la délipidation par CUBIC-L en suivant les étapes ci-dessous.
- Immerger le rein fixe dans 7 mL de CUBIC-L à 50 % (v/v) (mélange 1:1 d’eau et de CUBIC-L) dans un tube à fond rond de 14 mL (voir le tableau des matériaux) en agitant doucement à température ambiante pendant 6 h (figure 2A). Ensuite, immergez-le dans 7 mL de CUBIC-L dans un tube à fond rond de 14 mL en le secouant doucement à 37 °C pendant 5 jours.
- Actualisez CUBIC-L tous les jours pendant ce processus. Après le processus de décoloration et de délipidation, laver le rein avec du PBS à température ambiante pendant 2 h (trois fois) (Figure 1). Utilisez une cuillère distributrice pour la manipulation des échantillons (Figure 2B).
3. Coloration immunofluorescente à montage entier
- Préparez les tampons de coloration.
- Préparez le tampon de coloration pour les anticorps primaires en mélangeant 0,5 % (v/v) de Triton X-100, 0,5 % de caséine dans du PBS et 0,05 % d’azoture de sodium.
- Préparez le tampon de coloration pour les anticorps secondaires en mélangeant 0,5 % (v/v) de Triton X-100, 0,1 % de caséine dans du PBS et 0,05 % d’azoture de sodium.
- Effectuer une coloration avec des anticorps primaires.
- Immunocoloration du rein délipidé avec des anticorps primaires (1:100 ou 1:200, voir tableau des matériaux) dans le tampon de coloration à 37 °C avec une légère agitation pendant 7 jours.
note: La quantité de tampon de coloration nécessaire pour un rein est de 500 à 600 μL (figure 2C).
- Lavez le rein avec 0,5 % (v/v) de Triton X-100 dans du PBS (PBST) à température ambiante pendant 1 jour (Figure 1).
- Effectuer une coloration avec des anticorps secondaires.
- Immunocolorer le rein avec des anticorps secondaires (1:100 ou 1:200, voir tableau des matériaux) dans le tampon de coloration à 37 °C avec une légère agitation pendant 7 jours. Lavez le rein avec du PBST à température ambiante pendant 1 jour (figure 1).
- Après la fixation, immerger le rein dans du formaldéhyde à 1 % dans du PB (mélange 1:36 de formaldéhyde à 37 % et de PB) pendant 3 h, puis le laver avec du PBS à température ambiante pendant 6 h (figure 1).
4. Correspondance de l’indice de réfraction (IR)
- Préparez CUBIC-R+.
- Préparez CUBIC-R en mélangeant 45 % en poids de 2,3-diméthyl-1-phényl-5-pyrazolone/antipyrine et 30 % en poids de nicotinamide (voir le tableau des matériaux).
- Préparez CUBIC-R+ pour l’appariement de l’indice de réfraction (IR) en ajoutant 0,5 v % de N-buthyldiéthanolamine à CUBIC-R conformément aux rapports publiés précédemment.
- Effectuez la correspondance des instances réservées.
- Immerger le rein dans 7 mL de CUBIC-R+ à 50 % (v/v) (mélange 1:1 d’eau et de CUBIC-R+) dans un tube à fond rond de 14 mL en agitant doucement à température ambiante pendant 1 jour. Ensuite, immergez-le dans 7 ml de CUBIC-R+ dans un tube à fond rond de 14 ml en le secouant doucement à température ambiante pendant 2 jours (Figure 1).
note: Bien que le rein flotte dans 50 % de CUBIC-R+ au début de l’appariement des RI, il s’enfonce et devient transparent dans CUBIC-R+ à la fin du processus (Figure 2D).
5. Acquisition et reconstruction d’images
- Immergez le rein apparié à l’IR dans un mélange d’huile de silicium (RI = 1,555) et d’huile minérale (RI = 1,467) (55:45) pendant l’acquisition de l’image (RI = 1,51) (Figure 3).
- Acquérez des images 3D de l’ensemble du rein à l’aide d’un microscope fluorescent à feuillet de lumière fabriqué sur mesure (voir le tableau des matériaux). Collectez toutes les données d’image brutes dans un format TIFF 16 bits. Visualisez et capturez les images rendues en 3D avec le logiciel d’analyse d’imagerie (Imaris, voir Tableau des matériaux).
