Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut,
1. Collection de biopsies cutanées
- Laissez un médecin qualifié effectuer la biopsie cutanée dans un cadre clinique approprié.
- Choisissez la zone où effectuer la biopsie cutanée et nettoyez-la avec un tampon imbibé d’alcool.
- Préparez la solution anesthésique avec 1 cc de lidocaïne 2 %.
- Avec l’aiguille parallèle à la zone, injectez l’anesthésie locale par voie sous-cutanée.
- Après avoir vérifié l’effet de l’anesthésie, prenez le poinçon jetable de 3 mm et appliquez une pression rotative et délicate vers le bas pour le faire pivoter vers le bas à travers l’épiderme et le derme, jusqu’à ce que la graisse sous-cutanée soit atteinte.
- Retirez le coup de poing.
- À l’aide d’une pince jetable, tirez doucement le bouchon cutané vers le haut.
- À l’aide de ciseaux, découpez la base de l’échantillon au niveau du tissu adipeux.
- Placez l’échantillon dans un tube contenant 10 ml de solution fixatrice de periodat-lysine-paraformaldéhyde (PLP).
- Désinfectez la zone et couvrez-la d’un pansement adhésif.
2. Fixation et stockage des tissus
- Préparez une solution fixatrice PLP fraîche (voir tableau 1).
- Immédiatement après le prélèvement de la biopsie cutanée, l’immerger dans un tube contenant 10 mL de solution fixatrice de PLP et l’incuber pendant une nuit (H/N) à 4 °C.
- Le lendemain, sous la hotte, retirer délicatement le fixateur PLP et dans le même tube, laver la biopsie 3 fois pendant 5 min avec 5 mL de solution de Sorensen 0,1 M (tableau 1).
- Jeter la solution de Sorensen et incuber la biopsie avec 5 mL de solution cryoprotectrice O/N à 4 °C.
- Conservez la biopsie à 4 °C si l’incision avec un cryotome est effectuée dans un délai de 1 semaine ; conservez la biopsie à -20 °C si l’incision est effectuée dans les 3 mois ; intégrez la biopsie dans un cryomoule (étapes 3.2-3.4) et conservez-la à -80 °C pour la conserver plus longtemps.
3. Tissu coupé avec un cryotome
- Réglez le cryotome à -20 °C.
- Prenez un cryomoule et remplissez-le avec le milieu de cryo-enrobage. Évitez de créer des bulles.
- À l’aide d’une pince à épiler, immergez la biopsie dans le milieu de cryo-enrobage avec l’axe longitudinal (épiderme - derme) parallèle au fond du cryomoule.
- Congelez l’échantillon avec de l’azote liquide pour obtenir un cube solide de milieu de cryo-enrobage contenant la biopsie dans la bonne orientation.
- Mettez l’échantillon dans le cryostat et attendez 30 minutes pour permettre à la biopsie de s’acclimater.
- Fixez l’échantillon sur le cryostat et coupez des sections de 50 μm.
- À l’aide d’une petite brosse, transférez les cryosections dans une plaque à 96 puits contenant 200 μL de solution d’antigel dans chaque puits. Une section par puits.
- Conserver à -20 °C.
note: Si l’analyse de la biopsie entière n’est pas analysée, coupez-la seulement partiellement. Dans ce cas, les coupes doivent être conservées à -20 °C et la partie restante de la biopsie à -80 °C pour la conserver plus longtemps.
4. Coloration par immunofluorescence
- Remplissez une plaque à 96 puits, avec 100 μL de solution de lavage.
- Transférez les sections à analyser de la plaque de stockage à la nouvelle contenant la solution de lavage. 1 section par puits (4 sections par site anatomique, par patient : généralement un total de 12 sections par patient).
- Laissez la section dans la solution de lavage pendant 10 min à température ambiante (RT). Transférez la section dans un autre puits contenant la même solution et répétez le lavage.
- Déplacer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 μL de solution de blocage et incuber pendant au moins 90 min et pendant un maximum de 4 h à RT.
- Diluer les anticorps primaires anti-PGP9.5 (polyclonal de lapin, 1:1000) et anti-5G4 (monoclonal de souris, 1:400) dans la solution de travail.
- Transférez les sections dans de nouveaux puits contenant 100 μL de la solution de travail des anticorps primaires et incuberez-les O/N à RT.
- Comme étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min à RT, avec 100 μL de solution de lavage.
- Diluer les anticorps secondaires (conjugués avec différents fluorophores) : un anti-Lapin pour détecter PGP9.5 (1:700) et un anti-Souris Chèvre pour détecter 5G4 (1:700) dans la solution de travail.
- Transvaser les sections dans de nouveaux puits contenant 100 μL de la solution de travail des anticorps secondaires pendant 90 min à RT. À partir de ce point, couvrez la plaque à 96 puits avec une feuille d’aluminium pour éviter le blanchiment du fluorophore conjugué avec un ou plusieurs anticorps secondaires.
- À l’étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min, avec 100 μL de solution de lavage.
- Transvaser les sections dans de nouveaux puits contenant 100 μL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, dilué 1:5 000 dans une solution saline tamponnée au phosphate [PBS] 1x) pendant 5 min à RT.
- À l’étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min, avec 100 μL de solution de lavage.
- Montez les sections sur une glissière dans la bonne position en évitant les erreurs de pliage.
- Ajoutez quelques gouttes du support de montage sur la diapositive et recouvrez d’une lamelle.
- Laissez les lames sécher O/N avant d’utiliser le microscope confocal/à fluorescence.
- Stockez les lames dans une boîte appropriée à 4 °C en évitant l’exposition à la lumière. S’il est stocké avec précision, le signal sera visible pendant environ 6 mois.
note: Le transfert d’une section de la plaque à 96 puits contenant les tranches nouvellement coupées à la plaque à 96 puits contenant la solution de lavage (étape 4.1) est effectué à l’aide d’une petite brosse qui aide à prélever la biopsie. Après le transfert de la section dans le premier puits, chaque fois que la tranche doit être incubée avec une solution différente, déplacez-la de puits en puits à l’aide de la brosse.
5. Imagerie par immunofluorescence
- Visualisez des coupes à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée ou d’un microscope confocal (grossissement de 20X, 40x ou plus, utilisez des images successives par incréments de 2 μm sur un plan d’empilement Z pour de meilleurs résultats).
- Acquérir des images par une caméra connectée au microscope
- Utilisez un logiciel d’imagerie adéquat (c’est-à-dire ImageJ) pour analyser les signaux positifs en sections en termes de distribution spatiale et d’intensité du signal. Pour ce faire, effectuez les étapes mentionnées ci-dessous.
- Ouvrez le fichier à l’aide du logiciel ImageJ.
- Cliquez sur Image > couleur > diviser les canaux afin d’analyser chaque canal de couleur.
- Cliquez sur Image > pile > projet Z pour obtenir une fusion de plusieurs acquisitions de sections.
- Cliquez sur Image > couleur > fusionner les couches pour obtenir une fusion de différentes couches de couleur de la même acquisition.
Table 1 : Solutions requises. Liste des solutions requises pour le protocole et brève description de la façon de le préparer.
Solution antigel
(conserver à 4 °C jusqu’à 6 mois) | 30 % Glycérol
30 % Éthylène glycol
30 % dH2O
10 % 2x tampon phosphate |
Solution de blocage
(préparer sur le moment) | 4 % Sérum de chèvre normal
1 % Triton X-100
dans Solution de lavage |
Cryo-protecteur
(conserver à 4 °C jusqu’à 6 mois) | 20 % Glycérol
80 % la solution Sorensen |
Solution d’hydrogénophosphate disodique
(à conserver chez RT jusqu’à 6 mois) | 0,45M Hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4) en dH2O
Filtre dans une bouteille stérile |
Solution de lysine
(conserver à 4 °C jusqu’à 3 semaines) | 50 % de la solution de monochlorhydrate de L-lysine 0,3 M
50 % de la solution de 0,1M Sorensen pH 7,6
pH 7,4, filtre dans une bouteille stérile |
Paraformaldéhyde (PFA) 8 %
(préparer sous hotte et conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois) | 2,6 M PFA en dH2O (jusqu’à 55°C_do ne pas dépasser 60 °C pour éviter la formation d’acide formique)
filtre dans une bouteille stérile |
Tampon phosphate 2x
(conserver à 4 °C jusqu’à 6 mois) | Phosphate monosodique à 6 % (NaH2PO4) solution
Solution de phosphate disodique à 45 % (Na2HPO4) en dH2O |
solution de fixation PLP
(préparer pour le moment, sous hotte) | 25 % Paraformaldéhyde 8 %
0,01M (méta)periodate de sodium
Solution de lysine à 75 % |
Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté
(à conserver chez RT jusqu’à 6 mois) | 0,52M Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté (NaH2PO4*H2O) en dH2O
Filtrer dans une bouteille stérile. |
La solution de Sorensen
(à conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois) | Solution de phosphate monosodique à 2,5 %
Solution de phosphate disodique à 18,7 %
pH 7,6, en dH2O |
Solution de lavage
(préparer sur le moment) | 0.25M Trizma base
0,26 M NaCl
pH 7,6, en dH2O |
Solution de travail
(préparer sur le moment) | Solution de blocage à 50 %
50 % de solution de lavage |
