Utilisation de la tomographie médiée par fluorescence pour évaluer l’inflammation intestinale murine

Résumé

Source : Nowacki, T. M., et al. Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la quantification de l’inflammation intestinale murine liée aux macrophages. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo présente une technique d’évaluation de l’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite à l’aide de la tomographie médiée par fluorescence (FMT). Après avoir induit une colite chez une souris via du sulfate de sodium de dextran (DSS), l’animal reçoit une injection d’anticorps qui reconnaissent le marqueur de glycoprotéine F4/80 sur les macrophages infiltrés dans le côlon. La souris est ensuite imagée dans un dispositif FMT où les signaux de fluorescence et de réflectance sont reconstruits en une image tridimensionnelle pour déterminer la distribution spatiale et l’intensité de la fluorescence.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Matériaux et dispositif expérimental

1. Soins aux animaux.
   1. Utiliser des souris du même sexe et de la même souche d’âge de toute souche sensible au DSS (p. ex., C57BL/6) à un poids corporel de 20 à 25 g.
   2. Prévoyez au moins cinq souris ou plus par groupe expérimental et hébergez les souris conformément aux directives locales en matière de soins aux animaux.
   3. Fournir un régime alimentaire standard pour rongeurs et de l’eau potable autoclavée à volonté.
   4. Retirez la nourriture standard et remplacez-la par de la nourriture sans luzerne au moins trois jours avant le balayage pour réduire l’autofluorescence endoluminale.
2. Induction de la colite aiguë induite par le DSS.
   1. Dissoudre 2 g de DSS (poids moléculaire ~40 000 Da) dans 100 mL d’eau potable autoclavée pour obtenir une solution à 2 % (p/v).
   2. Remplissez l’abreuvoir des souris exclusivement avec la solution DSS et estimez 5 mL de liquide par souris et par jour. Fournir la même eau potable sans DSS aux souris témoins.
      note: Surveillez les souris quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérience. Euthanasier les souris qui ont perdu plus de 20 % de leur poids corporel initial ou qui deviennent moribondes (c.-à-d. posture voûtée persistante, mouvement diminué, respiration laborieuse, pelage nettement érigé) conformément aux directives locales applicables en matière de bien-être animal.
3. Préparation de la tomographie médiée par fluorescence.
   1. Étiqueter l'anticorps désiré (p. ex., anti-souris F4/80 chez le rat) avec un colorant de fluorescence (p. ex., cyanine7,_excitation λ : 750 nm,_émission λ : 776 nm) comme décrit dans le protocole du fabricant. Dialysez l’anticorps purifié dans une membrane de dialyse appropriée (taille des pores < 50-100 kDa) contre 1 L de chlorure de sodium 0,15 M pendant au moins 2 h ou toute la nuit.
      1. Transférez l’anticorps dans 1 L de NaHCO₃ 0,1 M et dialysez pendant au moins 2 h.
      2. Dissoudre la quantité requise de colorant fluorescent dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) (10,8 μL/mg d’anticorps) et l’ajouter à la solution d’anticorps. Utilisez le colorant fluorescent en excès molaire de 20 fois pour obtenir un rapport colorant/protéine de 1:3.
      3. Incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 1 h. Éliminer les anticorps non marqués par dialyse contre 1 L de sodium 0,15 M ou à l’aide d’une colonne de dessalage-10 et les résoudre dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour une application in vivo.
      4. Déterminer la concentration finale d’anticorps et le rapport de marquage par spectrophotométrie.
      5. Mesurez la concentration en protéines à une absorption de 250 à 330 nm et envisagez une absorption supplémentaire par le colorant. Corriger l’absorption maximale à 280 nm (protéine) par 11 % de l’absorption maximale à 750 nm (étape suivante) pour le marquage Cyanine.
      6. Mesurez une dilution du composé (généralement 1:10) à 250-800 nm et extrayez la concentration de Cyanine7 à 750 nm.
      7. Déterminez le rapport colorant/protéine comme suit : colorant/anticorps = absorption maximale à 750 nm / 200 000 / (absorption maximale à 280 nm - 0,11 x absorption maximale à 750 nm) / 170 000.
      8. Maintenez la solution d’anticorps à 4 °C et protégez-la de la lumière pour éviter le blanchiment avant l’injection.
   2. Chargez le volume de solution d’anticorps nécessaire dans une seringue stérile immédiatement avant l’injection et protégez-la de la lumière jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.
   3. Déterminer le moment optimal d’injection de la sonde et la procédure de balayage, en fonction de la pharmacocinétique du traceur.
   4. Anesthésiez les souris à l’aide d’isoflurane inhalé à 1,5 à 2,5 % dans de l’oxygène ou placez-les solidement dans un dispositif de contention dédié pour l’injection dans la veine caudale des anticorps marqués.
   5. Pour les anticorps complets, injecter l’anticorps marqué au moins 24 h avant l’examen, comme pour la visualisation des macrophages F4/80 chez la souris dans la colite murine. Injectez des souris par voie intraveineuse (i.v.) via la veine de la queue avec l’anticorps marqué en une quantité correspondant à 2,0 nmol de colorant.
   6. Utiliser des anticorps non spécifiques également marqués (par exemple, IgG de rat ou un autre isotype correspondant à l’héritage d’anticorps primaires) comme contrôle d’isotype à des doses équivalentes à celles de la sonde spécifique.
      note: Les résultats des balayages in vivo après injection du composé témoin peuvent servir de référence pour l’interprétation des données d’imagerie spécifiques de la sonde.
   7. Utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure de l’animal dans la région abdominale afin de minimiser la réflexion et l’absorption de la lumière.

2. Equipement technique

1. Utiliser un appareil de tomographie médiée par fluorescence (FMT) vétérinaire pour la fluorescence des petits animaux (figure 1).
2. Créez une nouvelle étude pour chaque projet en cliquant sur le bouton « nouvelle étude » et incluez dans la description de l’étude les traceurs pertinents, y compris les paramètres d’imagerie et les doses pour référence future.
3. Dans le cadre de cette étude, créez des groupes d’étude en fonction du plan d’étude respectif (par exemple, pour le traceur spécifique et le contrôle d’isotype non spécifique) en cliquant sur le bouton « nouveau groupe d’étude ». Équipez chaque groupe d’étude du nombre d’animaux correspondant.
4. Calibrez le système pour les constructions du traceur.
   1. Effectuez l’étalonnage de chaque lot de traceurs afin de normaliser la variation de l’étiquetage et de permettre une mesure quantitative à partir des données OI.
   2. Suivez les instructions du fabricant de l'instrument pour l'étalonnage de chaque système individuel ; une fois que vous avez sélectionné l'option « Ajouter un nouveau traceur », le système vous guidera tout au long des étapes. Fournir la dilution de la solution d’anticorps appliquée et la concentration absolue calculée du traceur dans la sonde.
   3. Pour la FMT, utilisez un fantôme imitant les tissus d’une épaisseur et d’une caractéristiques d’absorption définies (ressemblant à un tissu vital) et remplissez-le d’un volume spécifique de la solution d’anticorps utilisée. Mesurez cela sur le FMT device.
      note: Le système utilisera la mesure de référence de la sonde fournie, ainsi que la concentration donnée, pour calculer les concentrations absolues de traceurs à partir de futures mesures in vivo.
5. Utiliser une cassette d’examen chauffante à une température de 42 °C.
   note: Cela empêche les souris de devenir hypothermiques pendant l’examen.

3. Anesthésie animale

1. Utilisez un débit continu de 1,5 à 2 % vol. d’isoflurane ([2-chloro-2-(difluorométhoxy)-1,1,1-trifluoro-éthane]) et de 1,5 L_O2/min pour anesthésier les souris. Utilisez des systèmes d’inhalation spécialement conçus pour l’anesthésie des rongeurs (vaporisateur d’isoflurane) afin de contrôler facilement la profondeur de l’anesthésie et de minimiser l’exposition du personnel.
2. Placez la souris dans la chambre d’induction étanche et allumez le vaporisateur pour l’alimentation en isoflurane (100 % (v/v), 5 vol % en oxygène, 3 L/min). Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit allongée et inconsciente.
3. Placez-le dans la cassette d’examen pour la tomographie, avec une inhalation continue d’isoflurane par le cône nasal à une dose de 100 % v/v, 1,5 vol % dans l’oxygène, 1,5 L/min pour minimiser les artefacts de mouvement pendant l’examen. Pour les procédures qui durent plus de 5 minutes, appliquez une pommade oculaire sur les yeux de la souris pour prévenir les lésions cornéennes.
4. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant les réflexes. Posez la souris sur le dos ; Si l’anesthésie est suffisante, la souris ne doit pas se retourner. Pincez doucement la souris entre ses orteils ; Si l’anesthésie est suffisante, la jambe ne sera pas retirée (stade de tolérance chirurgicale).

4. Tomodensitométrie par fluorescence

REMARQUE : Adaptez les détails suivants, qui sont spécifiques au système FMT utilisé dans cette étude (voir le Tableau des matériaux) pour d’autres dispositifs d’imagerie par réflectance de fluorescence ou systèmes FMT, si nécessaire.

1. Placez la souris anesthésiée sur son dos dans la cassette d’examen.
2. Effectuez la procédure d’analyse.
   1. Insérez la cassette dans le système d’imagerie et fermez-la immédiatement pour assurer une anesthésie continue. Sélectionnez l’échantillon approprié dans le groupe d’étude créé précédemment. Sélectionnez le traceur administré dans le menu déroulant pour vous assurer que les valeurs de concentration du traceur sont correctement calculées.
   2. Acquérez l’image de réflectance de fluorescence à la longueur d’onde appropriée (720 nm pour Cyanine7) pour la planification du balayage et tracez le contour du champ de balayage en cliquant sur le bouton « Acquérir l’image ».
   3. Vérifiez que le champ de balayage apparaît en superposition sur l’image de réflectance de fluorescence. Ajustez-le à la région d’intérêt (par exemple, le côlon ou l’abdomen), en évitant l’air ou les zones de fourrure restantes. En fonction de la cible de l’image, définissez le nombre de points de données d’image dans le champ de balayage en choisissant la résolution de champ de balayage grossière à moyenne et fine dans le menu de droite.
      note: Gardez à l’esprit qu’un champ de balayage fin peut offrir une meilleure résolution spatiale au prix d’un temps de balayage nettement plus long.
   4. Lancez l’acquisition de données/images à la longueur d’onde sélectionnée en cliquant sur "scan
      note: Le temps de balayage pour un balayage moyennement fin de l’ensemble de l’abdomen sera d’environ 5 min ; Pendant ce temps, chaque point de données est éclairé séparément par le laser d’excitation et la fluorescence résultante est enregistrée.
   5. Retirez l’animal de la cassette d’imagerie à la fin de l’examen et laissez-le se rétablir complètement avant de le remettre dans la cage.
   6. Répéter la FMT si nécessaire à divers moments de l’expérience (p. ex., jours 0, 5 et 9 et 10 (fin de l’expérience)), mais tenir compte de l’accumulation d’anticorps dans le corps, augmentant ainsi le signal de fluorescence de fond.

5. Reconstruction et interprétation des données

1. Utilisez l’outil de reconstruction du logiciel d’imagerie concerné pour créer des cartes 3D de la distribution de la fluorescence à partir des données d’imagerie brutes ; les numérisations sont automatiquement ajoutées à l’outil de reconstruction lorsque, lors de la numérisation, la fonction « ajouter à la file d’attente de reconstruction » est sélectionnée.
   1. Sinon, sélectionnez les numérisations dans le menu déroulant sous l’étude et le groupe d’étude respectifs, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la numérisation et sélectionnez « ajouter à la reconstruction ».
2. Pour une analyse plus approfondie, chargez un ensemble de données dans le logiciel d’analyse. Dans le menu déroulant de la barre supérieure, sélectionnez l’étude respective, puis sélectionnez le groupe d’étude et l’animal individuel dans le menu de droite ; Tous les scans effectués pour cet animal seront affichés. Sélectionnez le bon balayage et cliquez sur « load."
   note: La reconstruction 3D de la distribution du traceur apparaîtra à gauche sous la forme d’une superposition de l’image de réflectance de fluorescence initialement acquise. Le modèle peut être pivoté et agrandi pour faciliter l’analyse.
3. Identifier les foyers d’accumulation de marqueurs non spécifiques (p. ex., foie ou vessie urinaire) sur des cartes 3D reconstruites et les différencier des tissus cibles (p. ex., intestin ou intestin).
4. Dans la barre supérieure, sélectionnez la forme de retour au roi la plus appropriée pour la cible. Étiqueter les tissus cibles en tant que régions d’intérêt (ROI) en plaçant les outils de mesure respectifs dans le logiciel d’analyse ; le logiciel fournira une intensité de fluorescence pour le retour sur investissement, ainsi que des quantités (pico-)molaires du traceur pour lequel le balayage a été calibré.
5. Sélectionnez la quantité totale de traceur dans le ROI approprié, normalisé pour la taille du ROI, comme l’équivalent le plus approprié pour l’évaluation de l’activité de la maladie en corrélation avec l’infiltrat inflammatoire (histologie).
   note: D’autres caractéristiques du retour sur investissement peuvent être choisies, le cas échéant, comme représentatives du modèle particulier.

Résultats

Graphique 1. Visualisation tomographique des infiltrats de macrophages dans la colite murine.

FMT chez les souris colitiques et les témoins non colitiques ayant reçu un anticorps conjugué à la cyanine7 contre la souris souris F4/80 (n = 5 par groupe). (A) Graphique à barres : l’intensité totale de fluorescence en pmol de colorant a été d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
Régime sans luzerne	Harlan Laboritories, Madison, États-Unis	2014
Pommade oculaire Bepanthen	Bayer, Leverkusen, Allemagne	80469764
Sulfate de dextran sodique (DSS)	Consulatat TdB, Uppsala, Suède	DB001
éosine	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne	E 4382
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne	E 9884
Florène 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Allemagne	Réf. B506
Haematoxylin	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne	HHS32-1L
Composé O.C.T. Tissue Tek	Sakura, Zoeterwonde, Pays-Bas	Réf. 4583	fixateur pour analyses histologiques
Saline tamponnée au phosphate, PBS	Lonza, Verviers, Belgique	4629
Chlorure de sodium 0,9 %	Braun, Melsungen, Allemagne	12211095/05/0411
Poudre de bicarbonate de sodium	Sigma Aldrich Deisenhofen, Allemagne	S5761
Régime alimentaire standard	Altromin, Lage, Allemagne	1320
Cryomoule Tissue-Tek	Sakura, Leiden, Pays-Bas	Réf. 4566
Hemoccult (test au papier de gaïac)	Beckmann Coulter, Allemagne	3060
Anticorps anti-F4/80 biotine rat	Serotec, Oxford, Royaume-Uni	MCA497B
Biotine rat-anti-souris anti-GR-1	BD Pharmingen, Heidelberg Allemagne	553125
Streptavidine-Alexa546	Sondes moléculaires, Darmstadt, Allemagne	Réf. S-11225	Excitation/émission maximale : 556/573nm
Anticorps anti-rat CD11b anti-souris TC	Calteg, Burlingame, États-Unis	R2b06
Anticorps F4/80 anti-souris purifié	BioLegend, Londres, Royaume-Uni	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne	D9542
Anticorps anti-Ly6C anti-souris conjugué au FITC	BD Pharmingen, Heidelberg, Allemagne	553104
Tampon FACS	BD Pharmingen, Heidelberg, Allemagne	342003
Cy7 NHS Ester	GE Healthcare Europe, Fribourg, Allemagne	PA17104
MPO ELISA	Immundiagnostik AG, Bensheim, Allemagne	K 6631B
Anticorps anti-souris F4/80 marqué Cy5.5	BioLegend, Londres, Royaume-Uni	123127	Anticorps étiquetés prêts à l’emploi (alternative)
Antigène anti-souris F4/80 PerCP-Cyanine5.5	eBioscience, Waltham, États-Unis	Tél. : 45 4801-80	Anticorps étiquetés prêts à l’emploi (alternative)
DMSO (Diméthylsulfoxyde)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne	Référence 67-68-5
L’isoflurane	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne	792632
éthanol	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne	Référence 64-17-5
Albumines sériques bovines (BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne	A4612
Solution saline tamponnée Tris (TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne	SRE0032
équipement
Système de cytométrie en flux FACS Calibur	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Allemagne
Système d’imagerie in vivo FMT 2000	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, États-Unis	FMT2000
Logiciel d’analyse d’imagerie True Quant 3.1	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, États-Unis	Inclus dans FMT2000
Microscope fluorescent Leica DMLB	Leica, 35578 Wetzlar, Allemagne	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlin, Allemagne	HD 2070	Homogénéisateur à ultrasons
Scalpel jetable n° 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne	Z692395-10EA
Ciseaux Metzenbaum 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Allemagne	22398330
Seringue Luer Lock 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne	Z248010
aiguilles de seringue	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Allemagne	Z192368
Tube Faucon 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgique	Référence 352070