Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Conception de l’agencement et de la production de tableaux personnalisés
- Générez une feuille de calcul de séquences peptidiques avec les appels d’allèles correspondants. Le réseau comporte 20 lignes et 30 colonnes et peut contenir jusqu’à 20x30=600 points pour les peptides. En fonction du nombre total de peptides enregistrés à l’étape 1.5 à partir d’un donneur particulier, et sur la base de notre expérience passée avec deux exemples que nous avions essayés, le réseau de 600 points peut contenir toutes les séquences générées à partir de ~2 cas de transplantation distincts.
- Planifiez rationnellement la manière la plus efficace d’ajuster les ensembles de peptides dans le format à 600 points du réseau.
- Si plus d'un sujet peut tenir dans un tableau entier, insérez des rangées vides après les séquences du premier donneur pour correspondre au nombre total de rangées pouvant être divisées par 30 (le nombre de points dans une rangée sur le tableau).
- Immédiatement après la dernière ligne vide pour le premier ensemble de séquences, collez toute la colonne du contenu de la séquence du deuxième cas de transplantation.
- Répétez ces étapes jusqu’à ce que le réseau soit rempli et qu’il ne soit plus possible d’ajouter d’autres cas sans dépasser les 600 emplacements. Si des rangées vides entières sont laissées à remplir en bas, « déplacez » la rangée vide à positionner entre les deux ensembles de donneurs. Ce large espace laissé entre les boîtiers facilite la coupe de la membrane après la fin de la synthèse - après l’étape 2.2. sous.
- Programmez les séquences peptidiques dans le contexte de la disposition du tableau. Le programme du synthétiseur SPOT prend un format de texte des séquences (une ligne, une séquence peptidique), qui peut être obtenu directement en enregistrant la feuille de calcul résultante de l’étape 1.1.4 sous forme de simple document texte (sans la ou les colonnes supplémentaires pour les noms d’allèles, les positions aa, etc.).
- Exécutez la synthèse automatisée de peptides via le synthétiseur SPOT. L’ensemble du fonctionnement de la synthèse est détaillé dans Kudithipudi et al. Notez que la synthèse Fmoc de deux réseaux prend ~4-5 jours.
2. Sonde et antisérum de sonde à partir d’une série chronologique d’un receveur de greffe individuel.
REMARQUE : Le réseau de membranes à 600 points a les dimensions ~7 cm x 13 cm. Après la synthèse, les réseaux peuvent être stockés à température ambiante sous forme de membranes sèches pendant au moins deux ans lorsqu’ils sont à l’abri de la lumière directe. Évitez le pliage excessif de la membrane afin de préserver sa longévité en cas d’utilisation répétée.
- Réhydratez le réseau de membranes avec de l’éthanol et visualisez les taches peptidiques colorées au Ponceau S.
- Réhydrater le réseau de membranes portant les peptides en suivant une procédure par étapes optimisée dans Li et al.
- Immergez la membrane du réseau dans 20 ml d’éthanol à 100 %.
- Ajouter 20 ml d’eau distillée pour diluer la solution à 50 % d’éthanol et incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Changez la solution d’immersion à 40 ml d’eau à 100 % trois fois et incubez 15 minutes à chaque fois.
- Laver dans un tampon approprié, par exemple 20 ml de TBST (solution saline tamponnée au Tris avec 0,1 %), trois fois pendant 5 minutes chacune.
- Coloration Ponceau S de la matrice pour visualiser les peptides synthétiques
- Ajouter 20 mL de solution pré-formulée de Ponceau S directement dans le réseau hydraté et incuber pendant ~30 secondes en agitant.
- Faites couler de l’eau distillée en continu sur la membrane pour détacher la couleur de fond Ponceau S. Au cours du processus, des taches peptidiques de couleur rouge peuvent devenir visibles.
- Séparez les parties du réseau pour chaque donneur en coupant soigneusement entre les sections du réseau pour des cas individuels. Marquez l’orientation de chaque tableau.
- Tableau de pré-blocs.
- Bloquez la membrane dans 20 mL de lait écrémé à 5 % dissous dans un tampon TBST. Cette solution à base de lait détachera davantage la couleur Ponceau S. Replacez le tampon de lait plusieurs fois afin d’obtenir les images peptidiques les plus claires.
- À des fins d’archivage, prenez une photo de l’image Ponceau S du réseau à l’aide d’un appareil photo portatif (exemple de la figure 1).
- Continuer à bloquer la membrane dans le lait écrémé à 5 % à 4 °C pendant la nuit ou à température ambiante pendant 2 h avec basculement.
- Matrice d’incubation avec antisérum de transplantation.
note: Il convient de noter qu’un phénomène connu sous le nom de prozone ou d’effet Hook peut résulter d’une interférence dépendante du complément dans l’analyse des anticorps sériques. Pour contourner ce problème, une étape facultative de prétraitement du sérum peut être envisagée avec de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou l’inactivation thermique des échantillons de sérum.
- Retirez le tampon de blocage et lavez la membrane avec 20 mL de TBST trois fois le lendemain pendant 5 minutes à chaque fois.
- Ajouter 20 μL du sérum brut du récipient à 20 mL de lait à 2,5 % dans un tampon TBST et incuber avec la membrane pendant 2 à 3 h à température ambiante. Il est à noter que dans cette première série de sondages, il est recommandé d’utiliser d’abord le dernier sérum post-greffe (ou probablement le sérum le plus sensibilisé) de la série chronologique. Ceci est basé sur l’hypothèse que les échantillons antérieurs de la série, en particulier à partir de points temporels pré-transplantation, ont moins de variété d’allo-anticorps qui ont tendance à se développer au fil du temps. De cette façon, toute possibilité d’interférence du signal due à un « transfert » entre les cycles de sondage peut être clairement distinguée de la réactivité des allo-anticorps réellement développée due aux réponses immunitaires contre le greffon.
- Lavez le réseau à l’aide de 20 ml de TBST et incubez-le avec un anticorps secondaire.
- Lavez la membrane trois fois pendant 10 minutes à chaque fois.
- Incuber avec l’anticorps secondaire IgG-HRP (Horseradish peroxydase) anti-humain de chèvre à une dilution de 1:10 000 dans un tampon TBST complété par du lait à 1 % pendant 2 h supplémentaires.
- Lavez et développez la tache.
- Lavez la membrane trois fois avec du TBST pendant 10 minutes à chaque fois.
- Effectuer une chimiluminescence améliorée (ECL) à l’aide de 5 mL de solution de luminol fraîchement mélangés à 5 mL de solution de peroxyde pour développer la membrane (pendant 1 min).
- Visualisez les signaux ECL à l’aide d’un imageur approprié (c’est-à-dire ChemiDoc Imaging Systems ou Azure C600).
- Scannez et quantifiez le transfert.
- Enregistrez les images développées (figure 2, image du bas) et effectuez la quantification de l’intensité du spot.
3. Comparez la réactivité de l’antisérum dans une série chronologique clinique.
- Supprimez le tableau.
- À ce stade, gardez la membrane humide en tout temps.
- Décaper la membrane en l’incubant avec 20 mL de tampon de décapage commercial à 37 °C pendant 20 min, puis laver la membrane avec du TBST trois fois pendant 10 min chacune. Répétez ensuite les étapes de blocage (étape 3.2) et de sondage (étape 3.3) en utilisant un sérum différent du patient prélevé à un moment différent.
- Membrane dénudée de blocs.
Remarque : Après le stripping, la membrane peut être réutilisée pour une autre série de sondes d’un sérum différent du même patient dans une série chronologique.
- Bloquez la membrane à l’aide d’un tampon de lait à 5 % comme précédemment (voir étape 2.2).
- Testez un antisérum différent de la même série chronologique (répétez les étapes de 2.3 à 2.6 ; exemple sur la figure 2, image du haut).
note: Le réseau dénudé peut ensuite être utilisé pour sonder un autre échantillon de sérum. Étant donné que les peptides sont conjugués de manière covalente à la matrice de support de la membrane, nous avons montré que le réseau peut être réutilisé pour jusqu’à 20 cycles de décapage et de résonance sans perdre ses performances.
