Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Production de glycopuces
- Préparation des microréseaux
- Imprimez les glycanes (50 mM) et les polysaccharides (10 μg/mL) dans une solution saline tamponnée au phosphate de 300 mM (PBS, pH 8,5) à 6 répétitions sur des lames de verre dérivées de N-hydroxysuccinimide, à l’aide d’un réseau robotique sans contact (volume de goutte ~900 pL). Chaque diapositive contient 4 blocs différents de sous-réseaux (Figure 1A, en couleurs) répétés 6 fois. Chaque sous-réseau est formé de 112 points de glycanes différents, y compris des contrôles (8 rangées × 14 colonnes) (Figure 1B).
note: Les informations relatives aux glycanes sont fournies dans le tableau 1. La bibliothèque de glycanes utilisée pour l’impression de micropuces est le résultat d’un effort de synthèse à long terme de l’équipe IBCh ; Des exemples de synthèse sont décrits dans des publications connexes. La bibliothèque de glycanes comprenait des antigènes de groupe sanguin et certains des oligosaccharides terminaux les plus fréquents, ainsi que des motifs de base de glycoprotéines et de glycolipides liés aux N et O de mammifères, d’antigènes glucidiques associés aux tumeurs et de polysaccharides de bactéries pathogènes.
- Incuber les lames dans une boîte d’humidité (humidité relative ~70 %) à température ambiante (25 °C) pendant 1 h.
- Microréseaux bloquants : incuber les lames pendant 1,5 h avec un tampon bloquant à température ambiante (100 mM d’acide borique, 25 mM d’éthanolamine, 0,2 % (v/v) de Tween-20 dans de l’eau ultrapure).
- Lavez la glycopuce à l’eau ultra-pure et séchez-la à l’air.
- Contrôle de la qualité de la puce glycochip
- Analyser deux microréseaux de chaque lot à l’aide d’une solution de préparation complexe d’immunoglobulines à 1 mg/mL (CIP, contenant des immunoglobulines : IgG, IgM et IgA), d’une solution de 10 μg/mL d’immunoglobulines anti-humaines de chèvre biotinylées en tant qu’anticorps secondaires (IgM + IgG + IgA), suivie d’une solution de 1 μg/mL du conjugué de streptavidine fluorescente correspondant (via le protocole décrit ci-dessous, voir l’étape 2).
- Scannez et analysez les glycopuces (voir étape 3, analyse de la matrice de glycanes).
- Utilisez des lots de micropuces avec une corrélation intra et inter-puce supérieure à 0,9.
2. Technique du réseau de glycanes
- Préparez les solutions aqueuses suivantes (dans de l’eau ultrapure) et conservez-les à température ambiante (25 °C) :
- Buffer-1 : 1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 1 % (v/v) de Tween-20 et 0,01 % (p/v) d’azoture de sodium (NaN3).
- Tampon-2 : 1 % (p/v) de BSA dans le PBS, 0,1 % (v/v) de Tween-20 et 0,01 % (p/v) de NaN3.
- Buffer-3 : 0,1 % (v/v) Tween-20 en PBS.
- Buffer-4 : 0,001 % (v/v) Tween-20 en PBS.
- Glycopuce et préparation d’échantillons
- Posez la boîte de rangement avec les lames sur la table jusqu’à ce qu’elles atteignent la température ambiante (25 °C).
note: Utilisez des gants en latex non poudrés. La glycopuce doit être manipulée par la partie inférieure de la glissière de verre, où se trouve le code-barres. Le code-barres vous aidera à identifier le côté droit, en évitant le contact avec la surface où les glycanes sont imprimés.
- Ouvrez la boîte, prenez la glycopuce et placez-la dans la chambre d’incubation (25 °C), déjà conditionnée avec du papier filtre humide pour maintenir l’humidité constante à l’intérieur de la chambre.
- Pendant ce temps, diluez le sérum de souris avec Buffer-1 (1:20) dans des tubes de 1,5 ml. Homogénéiser la solution sérique (5 s) à l’aide d’un mélangeur vortex.
note: Le volume nécessaire pour couvrir totalement la surface d’une seule glycopuce est d’environ 1 ml.
- Après l’homogénéisation, incuber le sérum dilué à 37 °C pendant 10 min dans un bain-marie pour éviter l’agrégation des immunoglobulines. Centrifugez les tubes pendant 3 min à 10 000 x g et 25 °C, récupérez le surnageant et jetez toute matière précipitée.
- Placez soigneusement la glycopuce dans la chambre d’incubation. Incuber pendant 15 min à 25 °C avec 1 mL de Buffer-3 pour éliminer toute matière résiduelle à la surface de la glycopuce.
- Tenez la glycopuce en position verticale et lavez-la à nouveau avec quelques gouttes de Buffer-3 à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Retirez délicatement le tampon de la surface de la glycopuce à l’aide de papier filtre.
3. Réaction : liaison des anticorps
- Placez la glycopuce dans la chambre d’incubation. Étalez l’échantillon de sérum dilué sur la surface de la glycopuce à l’aide d’une micropipette. Incuber avec agitation orbitale (30 tr/min) à 37 °C pendant 1,5 h. Assurez-vous que toute la zone sèche de la surface de la glycopuce est recouverte par l’échantillon de sérum dilué à l’aide de la pointe de la pipette.
- Retirez tout excès d’échantillon et plongez la glycopuce pendant 5 min dans le tampon-3 à 25 °C. Ensuite, déplacez la glycopuce dans un récipient avec Buffer-4 (5 min) et enfin lavez (5 min) la glycopuce avec de l’eau ultra-pure. Centrifugez le glycochip pendant 1 min à 175 x g et 25 °C pour éliminer le liquide.
4. Détection : anticorps secondaire
- Placez la glycopuce dans la chambre d’incubation. Étaler sur la surface de la glycopuce une solution (5 μg/mL) d’anti-souris de chèvre (IgG + IgM) conjuguée à la biotine dans le tampon-2. Incuber avec agitation orbitale (30 tr/min) à 37 °C pendant 1 h.
- Retirez la fraction non liée et répétez les étapes de lavage.
- Après la centrifugation, incuber la glycopuce dans l’obscurité à 25 °C pendant 45 min (30 tr/min) avec 2 μg/mL de la solution correspondante de streptavidine marquée au fluorochrome (dans le tampon-2).
- Dans l’obscurité, retirez la fraction non liée et répétez les étapes de lavage.
- Sécher la glycopuce à l’air.
note: Glycochip doit être scanné dès que possible. Mais s'il est impossible de faire un balayage immédiatement après la coloration, les glycopuces peuvent être stockées dans un endroit frais et sec dans l'obscurité.
3. Analyse des réseaux de glycanes
- Scanner le réseau
- Laissez la glycopuce sur la table jusqu’à ce qu’elle atteigne la température ambiante dans l’obscurité. En même temps, allumez le scanner de lames et le laser (longueur d’onde d’excitation de 633 nm).
- En tenant la puce à microréseau, glissez la glycopuce dans la fente jusqu’à ce qu’elle touche le dos.
- Scannez la glycopuce (« run easy scan ») et enregistrez le scan au format « . TIFF".
Tableau 1 : Liste des glycanes, leur liaison aux anticorps circulants naturels (IgM + IgG) des souris BALB/c (n = 20), exprimée en unités de fluorescence relative (RFU) en ± MAD médiane, et le nombre d’animaux dépassant le seuil (≥4000 RFU). Ce tableau a été reproduit à partir de Bello-Gil, D. et al. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
