Une technologie de microréseau peptidique pour le profilage de spécificité des anticorps

Résumé

Source : Cornett, E. M., et al. Analyse de la spécificité des anticorps histones avec des microréseaux peptidiques. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo présente une technique qui applique la technologie des microréseaux peptidiques pour profiler la spécificité des anticorps reconnaissant les modifications post-traductionnelles (PTM) sur les peptides d’histones. Une lame de microréseau contenant des peptides d’histones conjugués à des fluorophores immobilisés avec des combinaisons PTM connues est traitée avec des anticorps spécifiques de PTM cibles. Ce processus permet d'identifier la spécificité de l'anticorps pour la cible et sa réactivité croisée potentielle avec les PTM non cibles.

Protocole

1. Conception de la disposition de la diapositive du réseau et de la plaque source

1. Sous la rubrique « Planifier une mise en page de diapositive » sur l'interface ArrayNinja, cliquez sur le lien qui correspond à l'imprimante de microarray utilisée.
   note: ArrayNinja a été programmé pour imiter le mouvement robotique de deux imprimantes à microréseaux couramment utilisées (voir le tableau 1). La compatibilité avec les autres arrayers peut être configurée sur demande.
2. Cliquez dans la boîte de dialogue « Plaque de charge », tapez « vide », puis cliquez sur « Entrée ». Voir la figure 1 pour une capture d'écran du module de conception ArrayNinja.
3. Ajustez le diamètre du spot à 275 μm et l’espacement des spots à 375 μm. Ajustez les paramètres restants (Blocs de plaques/rangée de plaques, Nombre total de rangées de plaques, répétitions, caractéristiques en y, Super Arrays, SuperA fudge ; voir Figure 1) pour personnaliser la façon dont les caractéristiques apparaîtront sur la diapositive de la micropuce.
   note: Le diamètre du spot est déterminé par la taille de la broche de la puce à microréseaux. Au fur et à mesure que ces paramètres sont ajustés, la diapositive du dessin animé sera mise à jour en temps réel. Utilisez ce dessin animé pour prévisualiser la façon dont chaque paramètre modifie la disposition finale de la diapositive.
4. Une fois la mise en page des fonctionnalités de la diapositive finalisée, passez la souris sur chaque fonction unique et entrez l’identificateur de la fonctionnalité dans la boîte de dialogue contextuelle.
   note: Les identificateurs de caractéristiques peuvent être constitués de chiffres, de lettres ou de combinaisons. Cela n’est nécessaire que pour les fonctions uniques, et une boîte de dialogue n’apparaît pas lorsque des répliques sont sélectionnées.
5. Une fois que toutes les caractéristiques uniques ont reçu un identifiant, cliquez sur « Remplir ». Entrez un nom pour la mise en page de la diapositive et cliquez sur « Imprimer votre plaque » pour enregistrer. Une nouvelle page s’ouvrira et affichera le nombre de plaques sources à 384 puits nécessaires à la fabrication de la conception de diapositive choisie et un tableau cartographiant l’emplacement physique de chaque entité à charger dans la ou les plaques sources.
   note: Retenez ce nom, car il sera utilisé pour rappeler cette conception lors de l’analyse des données des microréseaux. En cliquant sur « imprimer votre plaque », vous enregistrez la mise en page dans ArrayNinja.

2. Fabrication de microréseaux

1. Préparation de la plaque source
   1. Utilisez la carte générée avec ArrayNinja pour créer la ou les plaques sources de 384 puits.
      REMARQUE : Des descriptions détaillées des peptides interrogés sur cette plateforme peuvent être trouvées ailleurs.
   2. Déposez 1 à 2 μL de chaque caractéristique (p. ex., peptide d’histones biotinylés) dans le puits approprié de la ou des plaques sources à 384 puits.
      note: Les peptides d’histones biotinylés sont généralement déposés à partir de solutions mères de 200 à 400 μM, ce qui équivaut à un excès molaire de 10 à 25 fois du peptide aux sites de liaison de la streptavidine dans un seul point de réseau. Ceci est calculé à l’aide de l’équation :
      2. Partitionnement des lames de microréseaux
      1. Stylo à cire hydrophobe (Figure 2C)
         1. Appliquez de la cire autour des zones qui contiennent des caractéristiques à l’aide d’un stylo à cire. Laissez la cire sécher à l’air libre pendant 5 minutes avant de passer à la section 3.
            note: Après le blocage, les points du réseau peuvent être très difficiles à visualiser à l’œil nu. Le design de la diapositive d’ArrayNinja peut être imprimé à l’échelle et utilisé comme guide pour l’application de la cire.
      2. Joint en silicone (Figure 2D)
         1. Décollez le film transparent de l’arrière du joint de la matrice et placez l’adhésif vers le bas sur la lame de la puce.
         2. Maintenez le joint en place pendant 5 s avant de passer à la section 3.
      3. Empreinte de cire (Figure 2E)
         1. Pour les lames conçues pour être cloisonnées par de la cire, imprimez une lame de test sur du verre ordinaire en utilisant 10 % de BSA. Utilisez cette diapositive de test pour optimiser les guides d’impression de cire ou les paramètres de la matrice afin de vous assurer que toutes les fonctionnalités seront dans les chambres de moulage en cire.
         2. Chauffer l’imprimante à cire à 85 °C jusqu’à ce que toute la cire soit complètement fondue, environ 30 min.
         3. Insérez la diapositive avec le côté imprimé vers le bas et poussez la lame jusqu’au guide droit sur l’imprimante de microréseaux. Tirez le levier vers le haut pour mettre le moule en contact avec la surface de la glissière. Maintenez pendant 2 s.
            note: Le temps de maintien peut être modifié pour obtenir une épaisseur de bordure de cire optimale.
         4. Retirez rapidement la lame et inspectez visuellement les bordures de cire pour vous assurer que tous les puits sont fermés et que les bordures ne sont pas si épaisses qu’elles n’empiètent pas sur les endroits. Rangez les lames à 4 °C, à l’abri de l’humidité et de la lumière.
            note: Le temps de maintien peut être augmenté ou diminué pour obtenir des bords plus épais ou plus fins.

      3. Hybridation d’un anticorps anti-histone PTM avec une puce à peptides

      1. Préparez un tampon d’hybridation (PBS, pH 7,6, 5 % BSA, 0,1 % Tween-20).
      2. Équilibrer le glissement dans le tampon d’hybridation à l’aide d’un récipient d’hybridation. Couvrir complètement la lame dans un tampon d’hybridation et incuber pendant 30 min à 4 °C sur un agitateur orbital à basse vitesse.
      3. Préparez une solution contenant de l’anticorps anti-PTM d’histone dilué dans un tampon d’hybridation.
         note: Dans les données d’exemple, l’anticorps d’histone #1 et l’anticorps #2 ont été dilués 1:1 000 dans un tampon d’hybridation. Une plage de dilution similaire à celle utilisée pour l’immunobuvard est recommandée comme point de départ.
      4. Incuber la matrice avec la solution d’anticorps pendant 1 h à 4 °C. Retirer la solution d’anticorps et laver la matrice 3 fois pendant 5 minutes à 4 °C avec du PBS froid, pH 7,6.
      5. Préparez une dilution de 1:5 000 à 1:10 000 d’anticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent dans un tampon d’hybridation.
      6. Incuber la matrice avec une solution d’anticorps secondaire pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière. Retirer la solution d’anticorps secondaire et laver la lame de la puce 3 fois pendant 5 minutes à 4 °C avec du PBS, pH 7,6. Trempez la puce à ADN dans un tube conique de 50 ml contenant 0,1 fois PBS, pH 7,6 pour éliminer l’excès de sel à température ambiante. Séchez la lame dans une centrifugeuse à microréseau à température ambiante.
      7. Numérisez la lame à l'aide d'un scanner de microréseaux d'une résolution de 25 μm ou plus, en suivant le protocole de balayage recommandé par le fabricant du scanner de microréseaux.
         note: Si un traceur de biotine marqué à la fluorescéine est présent, balayez à la fois le canal vert (ex : 488 nm, em : 509 nm) et le canal qui correspond à l’anticorps secondaire conjugué au colorant fluorescent, généralement rouge (ex : 635 nm, em : 677 nm). L’objectif de l’analyse est d’obtenir des fichiers .tif à canal unique qui peuvent être fusionnés en un seul fichier .png.

Résultats

Figure 1 : module de conception ArrayNinja. Une capture d’écran du module de conception ArrayNinja est illustrée par la ligne pointillée. Le panneau de commande (en haut) affiche tous les paramètres qui peuvent être modifiés sur l’imprimante à microarray. Au fur et à mesure que ces paramètres sont ajustés, l’image de dessin animé de la mise en page de la diapositive (en bas à gauche) est mise ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon d’impression	ArrayIt	Ppb
Bsa	Omnipure	Référence 2390
Lames de microscope en verre recouvertes de streptavidine	Greiner Bio-one	Référence 439003-25
Plaque de puits en polypropylène 384	Greiner Bio-one	784201
Biotine-fluorescéine	sigma	Référence 53608
Imprimante à microréseaux de contact	Aushon	Référence 2470	Imprimante à microréseaux Aushon 2470
Imprimante à microréseaux de contact	Machines à gènes	OmniGrid 100	Imprimante de microréseaux OmniGrid
Pbs	Invitrogen	Référence 14190
Tampon de blocage	ArrayIt	Les CFF
Stylo à cire hydrophobe	Laboratoires vectoriels	H-4000	Stylo PAP barrière hydrophobe ImmEdge
Joint en silicone	Grace Bio-labs	622511
Navire d’hybridation	Thermo Scientific	267061	ou bateau similaire
Anticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent	Technologies de la vie	A-21244	Alexa Fluor 647 (anti-lapin)
Anticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent	Technologies de la vie	A-21235	Alexa Fluor 647 (anti-souris)
Imprimante de cire	ArrayIt	MSI48
Préadolescent-20	Omnipure	Référence 9490
Scanner de microréseaux	Innopsys	InnoScan 1100AL	ou un scanner de microréseaux équivalent
Microréseau de peptides d’histones EipTitan	Épicypher	112001
Microréseau de peptides d’histones AbSurance Pro	Millipore	Référence 16668
Réseau de peptides d’histones MODifiés	Motif actif	Référence 13001
Microréseaux peptidiques Histone Code	JPT	His_MA_01
cire	Chêne royal	GulfWax (en anglais	pour imprimante à cire
Chambre d’hybridation de lames de microarray humidifiée	VWR	Référence 97000-284
Chambre de lavage de lames de microscope à haut débit	ArrayIt	HTW
Centrifugeuse à lames de microscope	VWR	Référence 93000-204
Anticorps 1	Abcam	Référence 8898
Anticorps 2	Millipore	Référence 07-473
Peptide d’histones biotinylé	ÉpiCypher	12-2001	Exemple de peptide. Des peptides similaires avec diverses modifications sont disponibles auprès de plusieurs sources commerciales.
ImageMagick			https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja			https://rothbartlab.vai.org/tools/