Une technologie de microréseau peptidique pour le profilage de spécificité des anticorps

1. Conception de la disposition de la diapositive du réseau et de la plaque source

1. Sous la rubrique « Planifier une mise en page de diapositive » sur l'interface ArrayNinja, cliquez sur le lien qui correspond à l'imprimante de microarray utilisée.
   note: ArrayNinja a été programmé pour imiter le mouvement robotique de deux imprimantes à microréseaux couramment utilisées (voir le tableau 1). La compatibilité avec les autres arrayers peut être configurée sur demande.
2. Cliquez dans la boîte de dialogue « Plaque de charge », tapez « vide », puis cliquez sur « Entrée ». Voir la figure 1 pour une capture d'écran du module de conception ArrayNinja.
3. Ajustez le diamètre du spot à 275 μm et l’espacement des spots à 375 μm. Ajustez les paramètres restants (Blocs de plaques/rangée de plaques, Nombre total de rangées de plaques, répétitions, caractéristiques en y, Super Arrays, SuperA fudge ; voir Figure 1) pour personnaliser la façon dont les caractéristiques apparaîtront sur la diapositive de la micropuce.
   note: Le diamètre du spot est déterminé par la taille de la broche de la puce à microréseaux. Au fur et à mesure que ces paramètres sont ajustés, la diapositive du dessin animé sera mise à jour en temps réel. Utilisez ce dessin animé pour prévisualiser la façon dont chaque paramètre modifie la disposition finale de la diapositive.
4. Une fois la mise en page des fonctionnalités de la diapositive finalisée, passez la souris sur chaque fonction unique et entrez l’identificateur de la fonctionnalité dans la boîte de dialogue contextuelle.
   note: Les identificateurs de caractéristiques peuvent être constitués de chiffres, de lettres ou de combinaisons. Cela n’est nécessaire que pour les fonctions uniques, et une boîte de dialogue n’apparaît pas lorsque des répliques sont sélectionnées.
5. Une fois que toutes les caractéristiques uniques ont reçu un identifiant, cliquez sur « Remplir ». Entrez un nom pour la mise en page de la diapositive et cliquez sur « Imprimer votre plaque » pour enregistrer. Une nouvelle page s’ouvrira et affichera le nombre de plaques sources à 384 puits nécessaires à la fabrication de la conception de diapositive choisie et un tableau cartographiant l’emplacement physique de chaque entité à charger dans la ou les plaques sources.
   note: Retenez ce nom, car il sera utilisé pour rappeler cette conception lors de l’analyse des données des microréseaux. En cliquant sur « imprimer votre plaque », vous enregistrez la mise en page dans ArrayNinja.

2. Fabrication de microréseaux

1. Préparation de la plaque source
   1. Utilisez la carte générée avec ArrayNinja pour créer la ou les plaques sources de 384 puits.
      REMARQUE : Des descriptions détaillées des peptides interrogés sur cette plateforme peuvent être trouvées ailleurs.
   2. Déposez 1 à 2 μL de chaque caractéristique (p. ex., peptide d’histones biotinylés) dans le puits approprié de la ou des plaques sources à 384 puits.
      note: Les peptides d’histones biotinylés sont généralement déposés à partir de solutions mères de 200 à 400 μM, ce qui équivaut à un excès molaire de 10 à 25 fois du peptide aux sites de liaison de la streptavidine dans un seul point de réseau. Ceci est calculé à l’aide de l’équation :
      2. Partitionnement des lames de microréseaux
      1. Stylo à cire hydrophobe (Figure 2C)
         1. Appliquez de la cire autour des zones qui contiennent des caractéristiques à l’aide d’un stylo à cire. Laissez la cire sécher à l’air libre pendant 5 minutes avant de passer à la section 3.
            note: Après le blocage, les points du réseau peuvent être très difficiles à visualiser à l’œil nu. Le design de la diapositive d’ArrayNinja peut être imprimé à l’échelle et utilisé comme guide pour l’application de la cire.
      2. Joint en silicone (Figure 2D)
         1. Décollez le film transparent de l’arrière du joint de la matrice et placez l’adhésif vers le bas sur la lame de la puce.
         2. Maintenez le joint en place pendant 5 s avant de passer à la section 3.
      3. Empreinte de cire (Figure 2E)
         1. Pour les lames conçues pour être cloisonnées par de la cire, imprimez une lame de test sur du verre ordinaire en utilisant 10 % de BSA. Utilisez cette diapositive de test pour optimiser les guides d’impression de cire ou les paramètres de la matrice afin de vous assurer que toutes les fonctionnalités seront dans les chambres de moulage en cire.
         2. Chauffer l’imprimante à cire à 85 °C jusqu’à ce que toute la cire soit complètement fondue, environ 30 min.
         3. Insérez la diapositive avec le côté imprimé vers le bas et poussez la lame jusqu’au guide droit sur l’imprimante de microréseaux. Tirez le levier vers le haut pour mettre le moule en contact avec la surface de la glissière. Maintenez pendant 2 s.
            note: Le temps de maintien peut être modifié pour obtenir une épaisseur de bordure de cire optimale.
         4. Retirez rapidement la lame et inspectez visuellement les bordures de cire pour vous assurer que tous les puits sont fermés et que les bordures ne sont pas si épaisses qu’elles n’empiètent pas sur les endroits. Rangez les lames à 4 °C, à l’abri de l’humidité et de la lumière.
            note: Le temps de maintien peut être augmenté ou diminué pour obtenir des bords plus épais ou plus fins.

      3. Hybridation d’un anticorps anti-histone PTM avec une puce à peptides

      1. Préparez un tampon d’hybridation (PBS, pH 7,6, 5 % BSA, 0,1 % Tween-20).
      2. Équilibrer le glissement dans le tampon d’hybridation à l’aide d’un récipient d’hybridation. Couvrir complètement la lame dans un tampon d’hybridation et incuber pendant 30 min à 4 °C sur un agitateur orbital à basse vitesse.
      3. Préparez une solution contenant de l’anticorps anti-PTM d’histone dilué dans un tampon d’hybridation.
         note: Dans les données d’exemple, l’anticorps d’histone #1 et l’anticorps #2 ont été dilués 1:1 000 dans un tampon d’hybridation. Une plage de dilution similaire à celle utilisée pour l’immunobuvard est recommandée comme point de départ.
      4. Incuber la matrice avec la solution d’anticorps pendant 1 h à 4 °C. Retirer la solution d’anticorps et laver la matrice 3 fois pendant 5 minutes à 4 °C avec du PBS froid, pH 7,6.
      5. Préparez une dilution de 1:5 000 à 1:10 000 d’anticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent dans un tampon d’hybridation.
      6. Incuber la matrice avec une solution d’anticorps secondaire pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière. Retirer la solution d’anticorps secondaire et laver la lame de la puce 3 fois pendant 5 minutes à 4 °C avec du PBS, pH 7,6. Trempez la puce à ADN dans un tube conique de 50 ml contenant 0,1 fois PBS, pH 7,6 pour éliminer l’excès de sel à température ambiante. Séchez la lame dans une centrifugeuse à microréseau à température ambiante.
      7. Numérisez la lame à l'aide d'un scanner de microréseaux d'une résolution de 25 μm ou plus, en suivant le protocole de balayage recommandé par le fabricant du scanner de microréseaux.
         note: Si un traceur de biotine marqué à la fluorescéine est présent, balayez à la fois le canal vert (ex : 488 nm, em : 509 nm) et le canal qui correspond à l’anticorps secondaire conjugué au colorant fluorescent, généralement rouge (ex : 635 nm, em : 677 nm). L’objectif de l’analyse est d’obtenir des fichiers .tif à canal unique qui peuvent être fusionnés en un seul fichier .png.

Figure 1 : module de conception ArrayNinja. Une capture d’écran du module de conception ArrayNinja est illustrée par la ligne pointillée. Le panneau de commande (en haut) affiche tous les paramètres qui peuvent être modifiés sur l’imprimante à microarray. Au fur et à mesure que ces paramètres sont ajustés, l’image de dessin animé de la mise en page de la diapositive (en bas à gauche) est mise à jour en temps réel. Une fois la mise en page définie, l’utilisateur peut passer la souris sur des points individuels pour saisir des identificateurs de caractéristiques uniques. ArrayNinja construit à partir de cette entrée utilisateur une carte de la position de chaque élément dans la ou les plaques sources (en bas à droite) nécessaires à la fabrication d’une disposition de diapositive de microréseau spécifiée.

Figure 2 : Fabrication de microréseaux. (A) Fabrication de microréseaux de peptides d’histones sur des lames de microscope recouvertes de streptavidine à l’aide d’une imprimante à microréseaux de contact. (B) Microréseaux fabriqués avec 3 sous-réseaux d’une grille de 48 x 48 caractéristiques peptidiques. Séparation de (C) 3 sous-réseaux avec un stylo à cire hydrophobe, (D) 2 sous-réseaux avec un adhésif au silicone, et (E) 48 sous-réseaux avec une empreinte de cire. Toutes les puces à ADN présentées sont fabriquées à l’aide de lames de microscope de 25 x 75 mm.

Figure 3 : Module d’analyse ArrayNinja. Une capture d’écran du module d’analyse ArrayNinja est présentée. Le panneau de configuration (en haut à gauche) affiche tous les paramètres qui peuvent être ajustés pour visualiser le réseau, trouver des points et aligner une grille sur l’image du réseau. En passant la souris sur une entité, une vue agrandie s’affiche (en haut à droite) et une fenêtre contextuelle contenant les informations d’identification associées à cette entité (en bas). Les points de référence sélectionnés pour la correction de l’arrière-plan sont orange. Les entités à exclure de l’analyse en aval sont blanches. ArrayNinja contient une fonction de recherche textuelle qui met en évidence les entités correspondantes en jaune, comme le montre l’exemple pour H4K16.