1. Préparation des embryons de poisson-zèbre
- Installez des bassins de passage de poissons dans l’après-midi avant 17h00, avec un poisson femelle de type sauvage et un poisson mâle Tg [ef1a :Myr-Tdtomato] en utilisant des séparateurs pour les séparer dans chaque réservoir.
- Enlever les séparateurs avant 11 h de tous les réservoirs de franchissement le lendemain matin. Restez silencieux et ne dérangez pas les poissons pendant qu’ils s’accouplent. Le frai a généralement lieu dans les 30 minutes suivant l’enlèvement des séparateurs. Les œufs fécondés restent au fond du réservoir.
- Récupérez les œufs fécondés dans les réservoirs avec un filtre à mailles. Transférez les ovules en les lavant dans une boîte de Pétri remplie d’eau d’œuf et examinez les embryons sous un microscope de dissection à un grossissement de 10x à 20x.
- Transférez les embryons fécondés dans une boîte de Pétridure propre contenant environ 20 ml de milieu embryonnaire (100 ml de solution mère 1 000x contenant 29,4 g de chlorure de sodium (NaCl), 1,27 g de chlorure de potassium (KCl), 4,85 g de chlorure de calcium dihydraté (CaCl2.2H 2O) et 8,13 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7H 2O)) avec des pipettes Pasteur en verre de grande taille. Conserver les embryons à 28 °C. Conserver 50 embryons fécondés par boîte de Pétri avec 30 ml de milieu embryonnaire à 28,5 °C.
REMARQUE : Un couple de poissons produit normalement 100 à 300 embryons, et le taux de fécondation et de survie des embryons sains est supérieur à 95 % pour chaque accouplement.
- Le lendemain matin, sortez les embryons de l’incubateur à 8h00, lorsque les embryons ont atteint le stade de développement de ~18-20 h après la fécondation (hpf). Observez-les au microscope à épifluorescence à un grossissement de 20x, en utilisant d’abord la lumière blanche. À ce moment-là, les embryons de poisson-zèbre sont au stade de 20 sommites.
- Jetez les embryons morts qui sont troubles ou rompus au microscope à l’aide d’une pipette en verre.
- Allumez la lampe fluorescente et choisissez le réglage du filtre de protéine fluorescente rouge (RFP) du microscope. Ensuite, sélectionnez les embryons avec une forte fluorescence rouge et transférez-les dans une nouvelle boîte avec de l’eau d’œuf.
- Déchorionnez les embryons manuellement à l’aide de deux pinces fines (les pointes de la pince doivent être tranchantes et non endommagées) sous une lumière blanche (Table des matériaux).
- Tenez le chorion avec une paire de pinces et faites une déchirure dans le chorion avec l’autre pince. Ouvrez la déchirure avec précaution à l’aide de la pince et rendez-la suffisamment grande pour que l’embryon puisse passer à travers en poussant doucement l’embryon avec les pointes des autres pinces.
- Transférez les embryons déchorionnés dans une nouvelle boîte de Pétri avec un milieu embryonnaire frais pour un rinçage rapide avant la micro-injection.
2. Préparation de la micro-injection
- Utilisez les capillaires (diamètre extérieur (1,2 mm de diamètre extérieur, 0,9 mm de diamètre intérieur, avec filament) pour tirer de fines aiguilles d’injection sur un extracteur. Concevoir et optimiser le programme de traction selon le manuel.
- Ouvrez la pointe de l’aiguille à l’aide d’une pince sous un microscope à stéréodissection. Faites en sorte que le diamètre de la pointe soit d’environ 10 μm et que l’angle de conicité soit d’environ 30°.
- Conjuguez l’anticorps monoclonal anti-Dld de souris avec l’anticorps anti-Souris-IgG-Atto647N avant l’injection.
- Pour chaque expérience d’injection, mélanger 0,5 μL de l’anticorps anti-Dld (0,5 mg/mL) avec 2 μL de l’anticorps anti-Mouse-IgG-Atto647N (1 mg/mL) en pipetant 5 à 10 fois. Ensuite, incubez à température ambiante pendant au moins 30 min (ou sur glace pendant 2-3 heures).
- Après l’incubation, ajoutez 2,5 μL de tampon bloquant (10 mg/mL d’IgG de souris) et 0,5 μL de rouge de phénol à 0,5 % au mélange d’anticorps et pipetez 10 fois pour bien mélanger afin de bloquer les anticorps non conjugués restant dans le mélange.
note: Pour chaque essai, préparez un mélange supplémentaire sans l’anticorps anti-Dld et utilisez-le comme témoin.
- Préparez de l’agarose à bas point de fusion à 1 % dans le milieu embryonnaire. Chauffer le mélange contenant de l’agarose à 70 °C jusqu’à ce qu’il devienne transparent.
- Aliquote de la solution d’agarose dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL. Conservez les aliquotes dans un bloc de chaleur à ~40 °C.
- Rincer l’embryon dans le tube contenant 1 % d’agarose à bas point de fusion pendant 3 s.
- Placez l’embryon sur un couvercle de boîte de Pétri en plastique inversé avec des gouttes individuelles d’agarose (~30-40 μL) pour monter chaque embryon séparément sur le couvercle, comme illustré à la figure 1. Posez les embryons à plat latéralement dans l’agarose et maintenez cette position jusqu’à ce que l’agarose se soit solidifiée à température ambiante.
- Montez 12 embryons en trois rangées, un par un, comme ci-dessus. Recouvrez tous les embryons montés dans l’agarose avec un milieu d’œuf.
3. Micro-injection
- Placez les embryons incrustés sous le stéréomicroscope et couvrez l’agarose avec de l’eau d’œuf.
- Placez l’injecteur de pression d’air avec les micromanipulateurs, en les plaçant à proximité des microscopes, comme illustré à la figure 1. Utilisez la bouteille de gaz en acier contenant de l’azote gazeux (N2) sous haute pression comme ressource d’air.
- N’ouvrez la vanne de gaz qu’après que les embryons aient été montés dans l’agarose. Ensuite, chargez l’aiguille de verre préparée avec 2 μL de mélange d’anticorps sur le micromanipulateur, comme illustré à la figure 1, lors de l’utilisation du module de remplissage frontal du micro-injecteur.
- Réglez la pression d’entrée à ~80-90 psi et la pression d’injection à ~20 psi.
- Calibrez le volume d’injection à l’aide d’un micromètre sous le microscope, comme décrit précédemment. Réglez la durée de la mélodie de 10 ms à 120 ms, en fonction de la taille de l’ouverture de l’aiguille. Délivrez chaque impulsion d’injection en tapotant la palette. Réglez le volume d’injection de chaque livraison à ~4-5 nL.
- Enfoncez la pointe de l’aiguille de micro-injection à travers la plaque du toit dorsal du cerveau postérieur jusqu’au point de charnière r0/r1, et injectez environ 10 nL (deux ou trois impulsions) de mélange d’anticorps sans toucher le tissu cérébral. Observez l’écoulement de fluides rouges dans le ventricule cérébral.
note: Le ventricule du cerveau postérieur est postérieur à la limite du mésencéphale postérieur. Le mélange d’anticorps contenant du rouge de phénol injecté remplit immédiatement le ventricule cérébral du cerveau postérieur au cerveau antérieur en diffusant avec du liquide céphalo-rachidien.
- Après l’injection, retirez rapidement la pointe de l’aiguille de l’embryon en tournant le bouton du micromanipulateur. Pour une injection réussie, le colorant rouge du mélange injecté reste stable dans le ventricule cérébral sans s’infiltrer dans l’agarose environnante.
- Déplacez la plaque de montage sous le microscope pour localiser un autre embryon monté à une position appropriée pour les répétitions.
- Après avoir injecté six à huit embryons, épluchez l’agarose avec un couteau microchirurgical pour libérer les embryons de l’agarose intégrée. Transférez les embryons microinjectés dans une boîte fraîche avec 30 ml de milieu embryonnaire et placez-les à température ambiante pour les prochaines étapes.
4. Montage et imagerie en direct en accéléré
- Après 30 min, transférez les embryons sélectionnés dans 10 mL de milieu embryonnaire. Ajouter 420 μL de stock de tricaïne (4 mg/mL) à 10 mL de milieu embryonnaire pour anesthésier les embryons.
- Pour monter les embryons, préparez de l’agarose à 0,8 % à bas point de fusion contenant la même concentration de tricaïne dans le tube. Conservez les aliquotes dans un bloc de chaleur à ~40 °C.
- À l’aide d’une pipette en verre, plongez les embryons injectés dans l’agarose chaude pendant 3 s. Ensuite, retirez immédiatement les embryons de l’agarose avec la même pipette en verre et placez les embryons au centre de boîtes de culture à fond en verre de 35 mm avec une goutte d’agarose du tube. Placez un seul embryon par goutte sur le verre.
- Orientez doucement les embryons à l’aide d’une sonde à fibres ou d’une pointe de chargement pour maintenir la face dorsale du cerveau embryonnaire aussi près que possible du fond de verre. Ajustez doucement la position de l’embryon pour étendre l’embryon sans le recourber à mesure que l’agarose se solidifie progressivement.
- Ensuite, vérifiez la position de l’embryon en retournant le plat à fond de verre. Assurez-vous que l’ensemble du cerveau antérieur dorsal avec les embryons correctement montés peut être vu au microscope.
- Ajouter 2 à 3 ml de milieu embryonnaire préchauffé à 28,5 °C contenant de la tricaïne pour couvrir l’embryon. Placez correctement la parabole sur la platine à température contrôlée du microscope confocal, comme illustré à la figure 1. Réglez la température de la chambre d’imagerie pour qu’elle soit à 28,5 °C. L’embryon est maintenant prêt pour l’imagerie.
