Immunolocalisation des protéines d’arabinogalactane et des pectines dans les tissus végétaux

Résumé

Source : Costa, M., et al. Immunolocalisation fluorescente des protéines arabinogalactanes et des pectines dans la paroi cellulaire des tissus végétaux. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente une technique d’immunomarquage pour localiser les protéines d’arabinogalactane (AGP) et les pectines dans les tissus végétaux. Des coupes de tissus végétaux fixes et enrobées de résine sont colorées avec des anticorps primaires et secondaires fluorescents spécifiques à l’AGP et à la pectine et un colorant fluorescent liant la cellulose pour révéler leur colocalisation spécifique au tissu dans la paroi cellulaire.

Protocole

1. Immunolocalisation

REMARQUE : La procédure d’immunolocalisation par fluorescence repose sur l’utilisation séquentielle de deux anticorps. L’anticorps primaire est élevé contre un antigène cible spécifique. L’anticorps secondaire est élevé spécifiquement contre l’anticorps primaire et, pour les techniques fluorescentes, il est conjugué à un fluorophore (FITC [fluorescéine isothiocyanate] dans ce protocole spécifique). L’anticorps primaire sera utilisé pour détecter l’antigène cible dans l’échantillon, et l’anticorps secondaire sera utilisé pour marquer l’endroit où l’anticorps primaire s’est connecté à l’échantillon après avoir lavé l’excès d’anticorps primaire. Les contrôles sont une partie importante de ce test et doivent toujours être effectués pour assurer l’exactitude des observations. Un puits sur la lame doit être réservé à l’utilisation comme témoin négatif, où le traitement par anticorps primaire sera sauté, et donc aucun signal ne doit être observé à la fin de l’expérience. Un témoin positif doit être inclus dans l’expérience en le traitant bien avec un anticorps dont le marquage est déjà connu et certain. Le témoin positif est utilisé pour confirmer l’efficacité du marquage secondaire de l’anticorps et les conditions de réaction, tandis que le témoin négatif teste la spécificité de l’anticorps secondaire.

1. Préparez une chambre d’incubation en plaçant des essuie-tout humides au fond d’une boîte d’embouts de pipette et en l’enveloppant dans du papier d’aluminium (figure 1B-1E). Placez les lames dans la chambre d’incubation.
2. Pipeter une goutte de 50 μL par puits de 8 mm de solution de blocage (5 % de lait écrémé en poudre (p/v) dans une solution saline tamponnée au phosphate [PBS]) et incuber pendant 10 min. Retirer la solution de blocage et laver tous les puits deux fois avec du PBS pendant 10 min.
3. Préparez les solutions primaires d’anticorps (voir tableau 1), 1:5 (v/v) dans une solution bloquante ; faites une estimation d’environ 40 μL par puits de 8 mm.
   note: La concentration de l’anticorps doit être ajustée selon le protocole du fabricant.
4. Effectuez un dernier lavage à l’eau doublement distillée (ddH₂O) pendant 5 min, ne laissez jamais les puits sécher complètement.
5. Pipetez la solution d’anticorps primaire vers les puits de réaction. Solution de blocage de pipette vers les puits de contrôle.
6. Fermer la chambre d’incubation et laisser reposer pendant 2 h à température ambiante, puis toute une nuit à 4 °C. Préparer la solution secondaire d’anticorps, 1 % dans une solution bloquante (v/v) d’environ 40 μL par puits. Gardez-le recouvert de papier d’aluminium.
7. Lavez tous les puits deux fois avec du PBS pendant 10 min, suivis de 10 minutes supplémentaires avec du ddH₂O. Assurez-vous qu’aucune trace de solution de blocage ou de dépôts n’est visible sur les puits.
8. Pipeter la solution secondaire d’anticorps dans tous les puits. À partir de maintenant, protégez les lames de la lumière.
9. Incuber pendant 3 à 4 h dans l’obscurité à température ambiante.
10. Lavez tous les puits deux fois pendant 10 min avec du PBS suivi d’un autre lavage de 10 min avec du ddH₂O.
11. Appliquez une goutte de calcofluor (1:10 000 (p/v) fluorescent plus brillant 28 en PBS) dans chaque puits. Sans lavage, appliquez une goutte de support de montage (voir le tableau des matériaux) sur chaque puits et placez une lamelle (Figure 2H).
12. Observez avec un microscope à fluorescence, équipé de lentilles 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 et 100x/1,40, utilisez des filtres UV (pour la coloration au calcofluor) et FITC, pour détecter respectivement la paroi cellulaire et l’immunolocalisation (Figure 2I). Utilisez les longueurs d’onde suivantes : excitation/émission (nm) 358/461 pour l’UV et 485/530 pour le FITC.
13. Pour une meilleure visualisation des résultats, superposez les deux images avec ImageJ ou similaire.

Tableau 1 : Liste des anticorps monoclonaux utiles. Le tableau ci-dessus représente un exemple d’anticorps disponibles, avec des informations sur leurs cibles et où ils peuvent être achetés.

nom	affinité	Disponible à l’adresse
LM2	Protéine d’arabinogalactane	Sondes d’usine (Leeds, Royaume-Uni)
LM5	Pectines
LM6	Arabinan
LM7	Homogalacturonane
LM8	Xylogalacturonane
LM13	(1-5)-a-L-ARABINAN
LM14	Protéine d’arabinogalactane
LM16	Arabinan transformé - RG-I
LM18	Homogalacturonane
LM19	Homogalacturonane
LM20	Homogalacturonane
LM26	GALACTANE RAMIFIÉ
LM30	Protéine d’arabinogalactane
JIM5	Homogalacturonane faiblement méthylestérifié	CCRC (Géorgie, États-Unis)
JIM7	Homogalacturonane hautement méthylestérifié
JIM4	Protéine d’arabinogalactane
JIM8	Protéine d’arabinogalactane
JIM13	Protéine d’arabinogalactane
JIM15	Protéine d’arabinogalactane
JIM16	Protéine d’arabinogalactane
JIM20	Extensine
Référence MAC207	Protéine d’arabinogalactane

Résultats

Graphique 1. (A) Représentation schématique de la séquence de coupe des blocs pour la préparation de l’échantillon (bloc jaune) pour la coupe avec l’ultramicrotome. Tout d’abord, la capsule de gélatine est retirée (1). Ensuite, ils sont d’abord coupés à un angle de 40° à 45° par rapport aux côtés de la capsule tangentiellement à l’échantillon (2), une deuxième coupe est effectuée à 90° de la p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lames de réaction en verre à 8 puits	Marinfeld	MARI1216750	D’autres marques peuvent être utilisées
Anticorps anti-IgG (molécule de wole)-FITC produits chez le GOAT	Sigma-Aldrich	Réf. F6258
lamelles de protection, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	La lamelle doit couvrir tous les puits. D’autres marques peuvent être utilisées
jjH2O	Na	Na
Éthanol absolu	Na	Na
Azurant 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Lait écrémé en poudre	Nestlé	Na	tout lait écrémé en poudre est adéquat
four	Na	Na	four de laboratoire générique
Anticorps monoclonal généré par le rat	Sondes pour plantes	Na	Plusieurs anticorps qui reconnaissent les composants de la paroi cellulaire sont disponibles à la fois au centre de recherche sur les glucides complexes (CCRC, Georgia University, États-Unis) et chez Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, à l’Université de Leeds, au Royaume-Uni). Une courte liste de certains MABS couramment utilisés et des endroits où ils peuvent être achetés est présentée dans le tableau supplémentaire 1
microscope à épifluorescence droit avec filtres de fluorescence UV et FITC	Leica Mycrosistems	DMLb
chambre à vide	Na	Na
Pompe à vide	Na	Na
Bouclier de Vecta	Laboratoires vecta	T-1000	D’autres anti-décoloration peuvent être utilisés. Veuillez vérifier la compatibilité avec FITC et l’azurant 28. (Remarque : pour une solution de rechange non commerciale, (voir Jonhson et coll. 198218) Un milieu anti-décoloration peut être fabriqué en mélangeant 25 mg/mL de 1,4-diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) dans du glycérol 9:1 (v/v) à du 1xPBS. Ajustez le pH à 8,6 avec du HCl dilué.)