Immunolocalisation des protéines d’arabinogalactane et des pectines dans les tissus végétaux

Résumé

Source : Costa, M., et al. Immunolocalisation fluorescente des protéines arabinogalactanes et des pectines dans la paroi cellulaire des tissus végétaux. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente une technique d’immunomarquage pour localiser les protéines d’arabinogalactane (AGP) et les pectines dans les tissus végétaux. Des coupes de tissus végétaux fixes et enrobées de résine sont colorées avec des anticorps primaires et secondaires fluorescents spécifiques à l’AGP et à la pectine et un colorant fluorescent liant la cellulose pour révéler leur colocalisation spécifique au tissu dans la paroi cellulaire.

Protocole

1. Immunolocalisation

REMARQUE : La procédure d’immunolocalisation par fluorescence repose sur l’utilisation séquentielle de deux anticorps. L’anticorps primaire est élevé contre un antigène cible spécifique. L’anticorps secondaire est élevé spécifiquement contre l’anticorps primaire et, pour les techniques fluorescentes, il est conjugué à un fluorophore (FITC [fluorescéine isothiocyanate] dans ce protocole spécifique). L’anticorps primaire sera utilisé pour détecter l’antigène cible dans l’échantillon, et l’anticorps secondaire sera utilisé pour marquer l’endroit où l’anticorps primaire s’est connecté à l’éc....

Résultats

Graphique 1. (A) Représentation schématique de la séquence de coupe des blocs pour la préparation de l’échantillon (bloc jaune) pour la coupe avec l’ultramicrotome. Tout d’abord, la capsule de gélatine est retirée (1). Ensuite, ils sont d’abord coupés à un angle de 40° à 45° par rapport aux côtés de la capsule tangentiellement à l’échantillon (2), une deuxième coupe est effectuée à 90° de la p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lames de réaction en verre à 8 puits	Marinfeld	MARI1216750	D’autres marques peuvent être utilisées
Anticorps anti-IgG (molécule de wole)-FITC produits chez le GOAT	Sigma-Aldrich	Réf. F6258
lamelles de protection, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	La lamelle doit couvrir tous les puits. D’autres marques peuvent être utilisées
jjH2O	Na	Na
Éthanol absolu	Na	Na
Azurant 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Lait écrémé en poudre	Nestlé	Na	tout lait écrémé en poudre est adéquat
four	Na	Na	four de laboratoire générique
Anticorps monoclonal généré par le rat	Sondes pour plantes	Na	Plusieurs anticorps qui reconnaissent les composants de la paroi cellulaire sont disponibles à la fois au centre de recherche sur les glucides complexes (CCRC, Georgia University, États-Unis) et chez Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, à l’Université de Leeds, au Royaume-Uni). Une courte liste de certains MABS couramment utilisés et des endroits où ils peuvent être achetés est présentée dans le tableau supplémentaire 1
microscope à épifluorescence droit avec filtres de fluorescence UV et FITC	Leica Mycrosistems	DMLb
chambre à vide	Na	Na
Pompe à vide	Na	Na
Bouclier de Vecta	Laboratoires vecta	T-1000	D’autres anti-décoloration peuvent être utilisés. Veuillez vérifier la compatibilité avec FITC et l’azurant 28. (Remarque : pour une solution de rechange non commerciale, (voir Jonhson et coll. 198218) Un milieu anti-décoloration peut être fabriqué en mélangeant 25 mg/mL de 1,4-diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) dans du glycérol 9:1 (v/v) à du 1xPBS. Ajustez le pH à 8,6 avec du HCl dilué.)