Utilisation d’un ELISA sandwich pour déterminer la teneur en glycoprotéines immunogènes d’un vaccin

Résumé

Source : Jallet, C. et al., Test ELISA in vitro pour évaluer la puissance du vaccin contre la rage.J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo présente un test immuno-enzymatique indirect ou un test d’immunocapture sandwich ELISA conçu pour évaluer les niveaux de glycoprotéines immunogènes dans les vaccins. La plaque de test, contenant des anticorps spécifiques aux glycoprotéines, est incubée avec des échantillons de vaccin dilués en série, y compris des vaccins de référence et d’essai, suivie d’un immunodosage pour quantifier la teneur en glycoprotéines du vaccin testé.

Protocole

1. Précautions de sécurité

REMARQUE : Cette méthode s’applique à la fois au virus vivant de la rage (RABV) et au vaccin inactivé.

1. Utiliser les bonnes pratiques de laboratoire et les procédures de sécurité.
2. Portez un équipement de protection individuelle (EPI) adéquat, y compris un manteau jetable, des gants, des masques, des lunettes, etc.
3. Lorsque le virus vivant est titré, utilisez une enceinte de sécurité biologique de classe II.
   1. Considérer toute matière en contact avec les échantillons (réactifs, solutions de lavage, etc.) comme matière infectieuse.
   2. Traitez le matériau contaminé en l’immergeant dans la solution d’eau de Javel (2,5 % d’hypochlorite de sodium) pendant 30 min pour la décontamination.
4. Manipuler les produits chimiques conformément aux bonnes pratiques de laboratoire.

2. Préparation

1. Utilisez des réactifs de qualité analytique dans la mesure du possible.
2. Préparez des solutions fraîches de tampon d’enrobage/tampon carbonaté, de tampon de passivation, de diluant et de tampon de citrate (tableau 1), filtrez à travers des filtres de 0,45 ou 0,22 μm et stockez-les à 4 °C pendant une journée avant l’utilisation afin de préserver leur pureté analytique.
3. Laisser les réactifs atteindre la température ambiante (+18 °C à +25 °C) 30 min avant l’utilisation et homogénéiser en mélangeant doucement avant l’utilisation.

3. Sensibilisation des microplaques

REMARQUE : Utilisez des plaques d’immunodosage par adsorption à 96 puits qui sont optimisées pour lier de grandes quantités d’immunoglobulines (par exemple, voir le tableau des matériaux).

1. Dans chaque puits, ajoutez 200 μL d’anticorps monoclonal (mAb-D1) dilué dans le tampon carbonaté.
   note: Une concentration optimale d’environ 1 μg/mL a été déterminée expérimentalement et correspond à une dilution d’environ 1/2000 du mAb-D1 purifié. Cette concentration recommandée est indiquée pour chaque lot d’Ac-D1 et doit être vérifiée périodiquement avec le témoin positif.
2. Recouvrez la plaque d’un film adhésif et incubez la microplaque pendant 3 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée.
3. Aspirez soigneusement et transférez le contenu du puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5 %.
4. Retournez la microplaque et laissez-la sécher sur un papier absorbant à température ambiante pendant 5 min.

4. Passivation des microplaques

1. Dans chaque puits, ajoutez 300 μL de tampon de passivation.
2. Recouvrez la plaque d’un film adhésif et laissez incuber pendant 30 min à 37 °C.
3. Aspirez avec précaution et transférez le contenu du puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5 %.
4. Retournez la microplaque et laissez-la sécher sur un papier absorbant à température ambiante pendant 1 min.
   note: La microplaque peut être utilisée immédiatement ou stockée scellée à -20 °C jusqu’à 3 mois jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.

5. Dosage ELISA

REMARQUE : Pour établir la courbe de contrôle du vaccin de référence, l’étape 5.3 n’est pas nécessaire ; pour titrer le vaccin testé, toutes les étapes 5.1 à 5.6 sont nécessaires.

1. Lavage de la microplaque sensibilisée
   1. Dans chaque puits, ajoutez 300 μL de tampon de lavage.
   2. Aspirez avec précaution et transférez le contenu du puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5 %.
   3. Répétez les étapes 5.1.1 et 5.1.2 cinq fois de plus pour laver abondamment la plaque sensibilisée.
   4. Retournez la microplaque et laissez-la sécher sur un papier adsorbant à température ambiante pendant 1 min.
2. Dilutions du vaccin de référence pour la courbe de contrôle
   1. Reconstituer le vaccin de référence (antigène de validation, lot 09) dans 1 mL d’eau distillée correspondant à une concentration de 10 μg/mL de glycoprotéine du virus de la rage.
   2. Préparer une dilution dix fois plus importante du vaccin de référence reconstitué dans le diluant pour atteindre 1 μg/mL de glycoprotéine du virus de la rage.
   3. Préparer 6 dilutions en série de ce vaccin de référence dans le diluant comme indiqué dans le tableau 1.
   4. Répartir 200 μL du diluant en double (puits 1H/2H) pour servir de témoin à blanc.
   5. Répartir 200 μL par puits de chaque dilution du vaccin de référence en double (puits G1/G2 à A1/A2).
3. Dilutions du vaccin testé pour son titrage
   1. Préparez une dilution dix fois plus importante du vaccin testé dans le diluant.
   2. Préparez 7 dilutions en série du vaccin testé dans le diluant, comme indiqué dans le tableau 2.
   3. Répartir 200 μL par puits de chaque dilution de vaccin testée en double (puits H3/H4 à A3/A4).
4. Incubation/Lavage de la plaque ELISA
   1. Recouvrez la microplaque d’un film adhésif et laissez incuber pendant 1 h à 37 °C.
   2. Retirez le film, aspirez avec précaution et transférez le contenu de chaque puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5 %.
   3. Dans chaque puits, ajoutez 300 μL de tampon de lavage.
   4. Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5 %.
   5. Répétez les étapes 5.4.3 et 5.4.4 cinq fois pour éliminer l’antigène non lié et conserver les trimères de protéine G liés à l’anticorps enrobé (mAb D1).
   6. Retournez la microplaque et laissez-la sécher sur un papier absorbant à température ambiante pendant 1 min.
5. Liaison de la mAb-D1 conjuguée à la peroxydase
   1. Répartir 200 μL par puits de la dilution recommandée (1/2000) de l’Ac-D1 marqué à la peroxydase dans un diluant (concentration approximative de 1 μg/mL). Une concentration recommandée est indiquée pour chaque lot d’Ac-D1 et doit être vérifiée périodiquement avec le témoin positif.
   2. Recouvrez la microplaque d’un film adhésif et laissez incuber pendant 1 h à 37 °C.
   3. Retirez le film, aspirez avec précaution et transférez le contenu de chaque puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5 %.
   4. Ajouter à chaque puits 300 μL de tampon de lavage.
   5. Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5 %.
   6. Répétez les étapes 5.5.4 et 5.5.5 cinq fois pour retirer l’anticorps non lié marqué à la peroxydase (mAb D1).
   7. Retournez la microplaque et laissez-la sécher sur un papier absorbant à température ambiante pendant 1 min.
6. Révélation à l’aide d’un substrat-chromogène
   1. Distribuer 200 μL par puits de solution substrat-chromogène.
   2. Scellez la microplaque avec un film et incubez dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min. Une couleur jaune-orange se développe, dont l’intensité est proportionnelle à la quantité d’anticorps marqués à la peroxydase liés (mAb D1).
   3. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 μL de solution d’arrêt par puits.
   4. Essuyez soigneusement le bas de la microplaque et placez-la dans un spectrophotomètre pour déterminer la densité optique (DO) à 492 nm de tous les puits utilisés : témoin négatif (blanc), vaccin de référence et vaccin testé.
   5. Collectez des données de DO au format .xls ou .xlsx fichier pour analyse.

Table 1. Tampons utilisés dans le test.

Tampons et réactifs	préparation
Tampon de revêtement (Tampon carbonaté 50mM pH=9,6)	Ajouter du carbonate de sodium 50 mM (Na2CO 3-10H2O) au bicarbonate de sodium 50 mM (NaHCO3) jusqu’au pH souhaité (environ 1/10 volume de bicarbonate de sodium)
Tampon de passivation	0,3 % d’albumine sérique bovine (BSA, fraction V), 5 % de saccharose dans un tampon carbonaté 50 mM pH 9,6
10x Saline tamponnée au phosphate pH = 7 (PBS 10x)	NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO 4-12H2O 11,33 g, KH2PO4 2g dans 1L d’eau distillée. Ajuster le pH = 7 avec du NaOH 4N
Tampon de lavage	0,05 % de préadolescent dans 1x PBS
diluant	0,5 % d’albumine sérique bovine (fraction V), 0,05 % de Tween dans 1x PBS (ajuster le pH à 7 en raison de l’acidification par BSA)
Tampon citrate pH-5.6 (pour substrat peroxydase)	11,67 g de citrate trisodique-2H2 O (Na3C6H5O7-2H 20), 2,17 g d’acide citrique-1H20 dans 1L d’eau distillée
Solution substrat-chromogène	50 mg Ortho-phénylène diamine comprimé, 0,1 % Peroxyde d’hydrogène 30 % (110 vol) dans 25 ml Tampon citrate pH 5,6
Solution d’arrêt (Acide sulfurique 4N)	10 ml de H2SO4 36N dans 80 ml d’eau distillée refroidie. La dilution doit être effectuée dans un bain de glace

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Enceinte de sécurité biologique de classe II	ThermoFisher Scientific	10445753	En cas de titrage d’un virus vivant
Plaques immuno-non stériles transparentes à fond plat à 96 puits, 400 μL, MAXISORP	ThermoFisher Scientific	439454	Bon pour la liaison à l’anticorps chargé
Hotte de laboratoire en polypropylène Equip Labo	ThermoFisher Scientific	12576606	Pour la préparation de l’acide sulfurique
Plaque d’immunologie Strong Adsorption MAXISORP Fond Plat Puits F96	Dutscher	Référence 55303	Bon pour la liaison à l’anticorps chargé
Ruban d’étanchéité pour microplaques (100 feuilles)	ThermoFisher Scientific	Référence 15036
Lecteur monomode de microplaques Sunrise	TECAN
Agitateur-incubateur de microplaques	Dutscher	441504
Laveur de microplaques Wellwash	ThermoFisher Scientific	Référence 5165000
Pipette multicanaux (30-300 μL) 12 canaux	ThermoFisher Scientific	Réf. 4661180N
Pipettes monocanal (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL et 100-1000 μL)	ThermoFisher Scientific	4700880