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1. Couplage de nanoparticules magnétiques (MNP)
- Utilisez une procédure de couplage commerciale et des réactifs pour coupler les MNP avec des anticorps (Abs) (généralement 1 mg). Des nanoparticules d’oxyde de fer avec de l’acide carboxylique comme groupes réactifs sont utilisées.
- Si les anticorps sont dans un volume supérieur à 0,5 ml, concentrez-les à l’aide d’un concentrateur 100K. Essorer à 2 000 x g pendant 3 à 5 min.
- À la fin de la procédure, après avoir ajouté 10 μl de tampon de trempe, transférez les MNP dans un tube de 12 mm x 75 mm et ajoutez 3 ml de tampon de lavage/stockage. Placez le tube dans le trou central d’un séparateur magnétique et laissez-le reposer toute la nuit à 4 °C.
- Vérifiez que les PMN se sont tous accumulés sur le côté du tube, puis pipetez soigneusement tout le liquide. Ajoutez 3 ml de tampon de lavage/stockage frais et remettez-le dans l’aimant.
- Après plusieurs heures, vérifiez si les MNP sont collectés sur le côté du tube, puis pipetez le liquide. Utilisez 2 ml de tampon de lavage/stockage pour remettre les MNP en suspension et les conserver à 4 °C.
- Vérifiez que les Abs sont couplés aux MNP en les marquant avec un fragment d’anticorps Fab fluorescent pertinent (par exemple, anti-souris de chèvre si vous utilisez un Ab monoclonal de souris pour la capture comme décrit dans la section 2) et exécutez-les sur un cytomètre en flux.
2. Marquage des anticorps couplés aux MNP
- Combinez 60 μl (3,9 x10 12 particules) de MNP (par condition) et 5 μl (d’une solution commerciale de 200 μg/ml) de fragments Fab marqués, spécifiques de l’isotype de l’Ab de capture dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
- Incuber à température ambiante (RT) pendant 30 min avec mélange continu.
- Pré-mouiller un concentrateur 100K avec 300 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et faire tourner dans une microcentrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 min.
- Purifier les complexes marqués sur une colonne de 100K. Faites tourner le mélange à partir de l’étape 2.2 dans une microcentrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 min, lavez avec 200 μl de PBS et récupérez dans le volume initial.
3. Utilisation de complexes Ab-MNP marqués pour capturer des particules d’intérêt (vésicules extracellulaires, VE)
- Incuber des MNP pré-marqués de 60 μl (3,9 x 1012 particules) avec préparation EV (100 μl).
- Préparez les préparations EV à l’aide de différentes méthodes. Ici, purifiez les VE sur des gradients de saccharose, collectez-les dans du plasma pauvre en plaquettes à l’aide de réactifs de précipitation d’exosomes ou isolez-les directement à partir du plasma.
note: Des ratios optimaux doivent être déterminés pour chaque expérience et dépendent de la concentration de VE dans la préparation. La fraction MNP-Ab doit être supérieure de ~106 à la concentration de la fraction EV.
- Incuber 1 h à 4 °C pour les VE.
- Ajouter 2,5 % d’IgG de souris / IgG humaines pour bloquer la liaison Fc, vortex doux, incuber 3 à 5 min à RT.
- Ajoutez les concentrations recommandées par le fabricant ou les concentrations nominales de chaque Abs de détection et incubez 20 minutes supplémentaires à l’heure de l’art.
4. Séparation des VE capturés par MNP des anticorps non liés à l’aide de colonnes magnétiques
- Préparez la colonne de séparation magnétique pour l’utilisation en la plaçant dans un aimant séparateur.
- Prémouiller la colonne avec 500 μl de tampon de lavage (2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans PBS). Laissez le tampon de lavage s’écouler à travers la colonne.
- Ajoutez les complexes MNP-EV à la colonne et laissez tout le liquide s’écouler à travers. Ajoutez 500 μl de tampon de lavage dans la colonne, en laissant passer tout le volume.
- Répétez le lavage avec le tampon de lavage 2 fois de plus.
- Retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube de 12 mm x 75 mm pour la collecte des complexes MNP-EV retenus. Laissez la colonne reposer dans le tube à l’écart de l’aimant pendant 3 min. Ajoutez 200 μl de PBS et laissez les billes s’écouler par gravité, ajoutez encore 200 μl de PBS et fixez avec 200 μl de paraformaldéhyde à 4 % après élution.
note: Le paraformaldéhyde est un cancérogène suspecté et doit être manipulé avec une cagoule ventilée et des gants doivent être portés.
- Pour quantifier les VE uniques, utilisez les paramètres volumétriques sur l’échantillonneur à haut débit (HTS) ou, juste avant l’acquisition, ajoutez des billes de comptage de cytométrie en flux bien mélangées.
5. Analyse des VE capturées par les MNP à l’aide d’un cytomètre en flux
- Cytomètre en flux d’échauffement pendant 30 min.
- Exécutez des billes de contrôle de la qualité.
- Fixez un seuil de fluorescence des MNP ou des VE marqués. Utilisez un PBS filtré de 0,22 μm pour le seuil afin de réduire le « bruit » de fond. Réglez le seuil en ajustant la tension PMT au niveau où le PBS filtré ne donne aucun ou très peu d’événements.
- Exécutez des échantillons à basse température. (Utilisez un filtre en ligne supplémentaire de 0,04 μm pour le fluide de gaine placé en série derrière le filtre de gaine standard de 0,2 μm pour éliminer davantage les faux événements).