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1. Préparation des échantillons biologiques
REMARQUE : Le site anatomique choisi et le volume de prélèvement sanguin sont laissés à la discrétion de chaque investigateur et n’affecteront pas le résultat du test. Cependant, une fois obtenus, les échantillons doivent être manipulés conformément aux étapes énumérées ci-dessous.
- Préparation des échantillons de sérum
- Prélevez le volume de sang souhaité dans le tube de prélèvement de votre choix et laissez-le coaguler pendant au moins 30 minutes.
- Centrifugez l’échantillon pendant 10 min à 1 000 x g à température ambiante.
- Prélever immédiatement le sérum et le dosage ou l’aliquote dans des tubes de microcentrifugation en polypropylène et stocker les échantillons à ≤ -20 °C.
- Préparation d’échantillons de plasma
- Prélever le volume de sang souhaité à l’aide de tubes de prélèvement sanguin recouverts d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
- Centrifuger pendant 10 min à 1 000 x g à température ambiante dans les 30 minutes suivant le prélèvement.
- Prélever immédiatement le plasma et le doser, ou aliquote dans des tubes de microcentrifugation en polypropylène et stocker les échantillons à ≤ -20 °C.
- Préparation d’échantillons surnageants de culture tissulaire
- Centrifuger l’échantillon pendant 10 min à 1 500 x g à 4 °C pour éliminer les cellules et les débris.
- Prélever immédiatement le surnageant et le dosage ou aliquote dans des tubes de microcentrifugation en polypropylène et les stocker à ≤ -20 °C.
- Décongélation d’échantillons biologiques congelés
- Décongeler complètement tous les échantillons biologiques précédemment congelés sur de la glace et des tourbillons brièvement avant de les utiliser. Évitez plus de 2 cycles de gel/dégel.
note: Les échantillons utilisés dans ce protocole ont été obtenus en cultivant des splénocytes de souris BALB/c (1 x 106 cellules à 37 °C + 5 % de CO2 dans diverses conditions : non stimulé, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 μg/mL enrobé sur plaque) + αCD28 (1 μg/mL soluble), PMA (20 ng/mL) + ionomycine (500 ng/mL). Les surnageants de culture ont été prélevés après 48 h et traités comme décrit à la section 1.3.
2. Préparation du réactif
- Préparation de billes pré-mélangées immobilisées par des anticorps
- Flacon de billes pré-mélangées de sonicate pendant 1 min dans un bain de sonicateur à température ambiante, puis tourbillonner pendant 30 s avant utilisation. S’il n’y a pas de bain sonicateur, augmentez le temps du vortex à 1 min.
- Préparation du tampon de lavage
- Amenez le tampon de lavage 20x (20x PBS avec 1 % Tween-20) fourni avec le kit à température ambiante et vortex pour apporter tous les sels dans la solution.
- Diluez 25 mL de tampon de lavage 20x avec 475 mL d’eau déminéralisée. Conservez les portions inutilisées entre 2 °C et 8 °C jusqu’à un mois.
- Préparation de la matrice B (à utiliser uniquement avec des échantillons de sérum et de plasma)
- Ajouter 5,0 ml du tampon de dosage (PBS avec 1 % de BSA) inclus dans la trousse dans la bouteille contenant la matrice B lyophilisée. Attendre au moins 15 minutes pour une reconstitution complète, puis bien mélanger au vortex. Les restes de matrice B reconstituée peuvent être conservés à ≤ -70 °C jusqu’à un mois.
3. Préparation standard
REMARQUE : Chaque analyte de ce panel a une concentration standard maximale de 10 000 pg/mL.
- Ajouter 250 μL de tampon de dosage pour reconstituer le cocktail standard de cytokines Th de souris lyophilisé. Mélangez en remuant brièvement et laissez reposer le flacon à température ambiante pendant 10 min.
- Transférez le cocktail standard dans un tube de microcentrifugation en polypropylène étiqueté « C7 ». Cela sera utilisé comme la norme supérieure.
- Étiquetez 6 tubes de microcentrifugation en polypropylène comme C6, C5, C4, C3, C2 et C1.
- Ajoutez 75 μL de tampon de dosage dans chacun de ces tubes.
- Transférez 25 μL de l’étalon supérieur C7 dans le tube C6 et mélangez bien par vortex. Il s’agira de la norme C6.
- Continuez à effectuer des dilutions en série 1:4 en utilisant une nouvelle pointe de pipette pour chaque tube afin d’ajouter 25 μL de l’étalon précédent aux 75 μL de tampon de dosage dans le tube étalon le plus bas suivant, suivie d’un vortex pour obtenir les étalons C5, C4, C3, C2 et C1. Utilisez le tampon de dosage comme étalon de 0 pg/mL (C0).
4. Dilution de l’échantillon
REMARQUE : Des expériences pilotes préliminaires utilisant ce test avec plusieurs dilutions peuvent être nécessaires pour déterminer le facteur de dilution le plus approprié pour un ensemble particulier d’échantillons biologiques. Un facteur de dilution approprié produira des calculs de concentration pour l’échantillon qui se situent dans les limites de la courbe standard. Les étapes suivantes sont fournies à titre indicatif et peuvent devoir être déterminées empiriquement en fonction du type d’échantillon.
- Diluez 2 fois des échantillons de sérum ou de plasma avec un tampon de dosage (par exemple, diluez 50 μL d’échantillon avec 50 μL de tampon de dosage) dans des tubes de microcentrifugation en polypropylène.
note: Si une dilution supplémentaire de l’échantillon est nécessaire, les dilutions doivent être effectuées avec la matrice B au lieu du tampon de dosage pour garantir une mesure précise. L’ajout d’échantillons de sérum ou de plasma sans dilution entraînera une faible précision du test et peut obstruer la plaque filtrante. La matrice B est composée d’un pool de sérum de souris appauvri en cibles de test endogènes. Il est utilisé comme diluant pour le sérum ou le plasma afin d’éviter les effets de matrice, qui sont connus pour affecter la sensibilité analytique des immunoessais.
- Tester des échantillons de surnageant de culture cellulaire sans dilution.
note: Les niveaux d’analyte peuvent varier considérablement d’un échantillon à l’autre. Si nécessaire, diluez les échantillons surnageants à l’aide d’une nouvelle préparation du milieu de culture cellulaire ou du tampon de dosage correspondant.
5. Procédure de dosage
REMARQUE : Le test peut être effectué dans des plaques filtrantes en polypropylène, des tubes de tri cellulaire activé par microfluorescence (FACS) ou des microplaques à fond en V. La procédure de dosage sur plaque filtrante est recommandée en raison de sa bonne cohérence d’un échantillon à l’autre, de sa robustesse et de sa facilité de manipulation. Cette procédure nécessite une unité de filtration sous vide pour le lavage (fournie par l’utilisateur final).
- Laissez tous les réactifs se réchauffer à température ambiante (20 - 25 °C) avant utilisation.
- Placez la plaque filtrante sur un couvercle de plaque inversé à tout moment pendant les étapes de configuration du test et d’incubation afin que le fond de la plaque ne touche aucune surface, car cela pourrait provoquer des fuites.
- Maintenez la plaque verticale pendant toute la procédure de dosage, y compris les étapes de lavage, pour éviter de perdre des billes.
- Gardez la plaque dans l’obscurité ou enveloppée de papier d’aluminium pour toutes les étapes d’incubation.
- Exécutez tous les étalons et échantillons en double disposés sur la plaque dans un ordre séquentiel.
- Prémouillez la plaque filtrante en ajoutant 100 μL de 1 tampon de lavage dans chaque puits et laissez-la reposer pendant 1 minute à température ambiante (si vous utilisez une microplaque à fond de filtre).
- Retirez le volume tampon à l’aide du collecteur à vide (5 à 10 s). Ne pas dépasser 10 " Hg de vide. Épongez l’excès de tampon de lavage du bas de l’assiette en appuyant sur l’assiette sur une pile d’essuie-tout propres. Placez la plaque sur le couvercle de la plaque inversée.
note: Les étapes 5.1 et 5.2 peuvent être omises si le dosage est effectué à l’aide d’une microplaque à fond en V ou de microtubes FACS.
- Pour les échantillons de surnageant de culture cellulaire, ajoutez 25 μL de tampon de dosage dans tous les puits. Ajouter 25 μL de chaque étalon dans les puits étalons. Ajouter 25 μL de chaque échantillon dans les puits d’échantillonnage.
- Pour mesurer des échantillons de sérum ou de plasma, ajoutez 25 μL de matrice B dans les puits étalons. Ajouter 25 μL de tampon d’essai dans les puits d’échantillonnage. Ajouter 25 μL de chaque étalon dans les puits étalons. Ajouter 25 μL de chaque échantillon de sérum ou de plasma dilué dans les puits d’échantillon.
- Vortex : mélanger les billes pendant 30 s. Ajouter 25 μL de billes mélangées dans chaque puits, en secouant la bouteille de perles par intermittence pour éviter que les billes ne se déposent. Le volume final doit être de 75 μL dans chaque puits après l’ajout des billes.
- Scellez la plaque avec une scelleuse de plaques. Enveloppez toute l’assiette, y compris le couvercle de la plaque inversée, avec du papier d’aluminium. Placez la plaque sur un agitateur de plaques, fixez-la et secouez-la à environ 500 tr/min pendant 2 h à température ambiante. Pour éviter les fuites, n’appliquez pas de pression positive sur la scelleuse de plaques.
- Sans inverser, placez la plaque sur le collecteur d’aspiration, appliquez le vide comme précédemment et ajoutez 200 μL de 1x tampon de lavage dans chaque puits.
- Retirez le contenu des puits de la plaque de dosage par filtration sous vide. Épongez l’excès de tampon de lavage du bas de l’assiette avec un tampon absorbant ou des serviettes en papier. Répétez cette étape une fois de plus.
note: Si le test est effectué à l’aide d’une microplaque à fond en V ou de microtubes FACS, sautez les étapes 1.12 et 1.13. Au lieu de cela, centrifugez la plaque à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante, puis retirez le surnageant à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Ajouter 25 μL d’anticorps de détection (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits.
- Scellez la plaque avec une scelleuse de plaque neuve. Enveloppez toute l’assiette, y compris le couvercle de la plaque inversée, avec du papier d’aluminium.
- Placez la plaque sur un agitateur de plaque et secouez à environ 500 tr/min pendant 1 h à température ambiante.
- Sans mettre sous vide, ajoutez 25 μL de réactif de streptavidine-phycoérythrine (SA-PE) directement dans chaque puits. Aucune dilution du réactif n’est nécessaire.
- Scellez la plaque avec une scelleuse de plaque neuve. Enveloppez toute l’assiette, y compris le couvercle de la plaque inversée, avec du papier d’aluminium.
- Placez la plaque sur un agitateur à plaques et secouez à environ 500 tr/min pendant 30 min à température ambiante.
- Répétez l’étape 1.13 ci-dessus.
- Ajouter 200 μL de 1 tampon de lavage dans chaque puits. Suspendez à nouveau les perles sur un agitateur pendant 1 min.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez les échantillons de la plaque filtrante vers les tubes FACS pour lire les échantillons sur un cytomètre en flux.
note: Le volume de l’échantillon peut être augmenté de 200 μL à 300 μL en ajoutant 100 μL supplémentaires de 1 tampon de lavage à chaque tube pour éviter que l’échantillon ne s’épuise. Si nécessaire, les échantillons peuvent être conservés à 4 °C, à l’abri de la lumière et analysés le lendemain. Cependant, un stockage prolongé des échantillons peut entraîner une réduction du signal.