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1. Section des tissus et préparation des lames
- Coupez des coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) d’une épaisseur de 3 à 5 μm à l’aide d’un microtome.
- Flotter les sections sur de l’eau purifiée à une température d’environ 10 °C en dessous du point de fusion de la paraffine utilisée. Soulevez les sections de l’eau sur des lames de microscope spécialement traitées (voir le tableau des matériaux). Laissez l’eau s’écouler complètement des toboggans.
- Incuber les lames pendant la nuit à 50 °C pour améliorer l’adhérence des tissus des lames.
note: Il est préférable de préparer des tissus fraîchement sectionnés pour les protocoles IHC, bien que des coupes de contrôle positives et négatives aux EST puissent être préparées à l’avance et stockées. Les étapes 2 à 4 doivent être effectuées dans une hotte chimique.
2. Déparaffinisation et réhydratation
- Placez les lames avec les sections de tissu dans un panier de coloration en acier inoxydable (voir tableau des matériaux). Plongez le panier dans un bain de xylène (récipient de coloration en acier inoxydable) pendant 3 min, retirez-le et immergez-le à nouveau.
- Retirez le xylène et réhydratez les sections en les plongeant dans un bain d’éthanol absolu pendant 3 min. Retirez et immergez à nouveau.
- Faites sécher les sections à l’air libre et placez-les dans un bain d’éthanol à 90 % pendant 1 min. Transfert dans un bain d’éthanol à 70 % pendant une autre minute, suivi d’un transfert final dans un bain à 50 % d’éthanol pendant 1 min. Pour chaque traitement par bain d’éthanol, agitez doucement le panier coulissant deux fois et vidangez le panier avant le transfert suivant.
3. Récupération d’épitopes
- Immergez soigneusement les sections de tissu dans de l’acide formique à 98 % à température ambiante pendant 30 min. Rincez les sections à l’eau du robinet pendant 5 min, puis rincez deux fois à l’eau distillée.
prudence: L’acide formique est très corrosif. Des lunettes de protection et des gants doivent être portés.
- Effectuez la récupération d’antigènes induite par la chaleur (HIER) en suivant les étapes ci-dessous.
note: Cette étape est réalisée par autoclave hydraté à 121 °C pendant 30 min dans une chambre de pression spécifique (voir Tableau des matériaux).
- Préchauffez le tampon de citrate (10 mM, pH 6,1, voir tableau des matériaux) à 98 °C pendant environ 20 min dans un récipient de coloration en acier inoxydable placé à l’intérieur de la chambre de pression remplie de 500 mL d’eau distillée.
note: Pour la présente étude, le point de consigne du programme était de 1 (SP1) pour l’équipement spécifique utilisé.
- Une fois que l’alarme indique que l’équipement a atteint l’heure et la température programmées, immergez le panier avec les diapositives et lancez le programme jusqu’au point de consigne 2 (121° C pendant 30 min). À des fins de contrôle de la qualité, placez une section de ruban indicateur d’autoclave adhésif sur le panier pour surveiller la température et la pression, et enregistrez la pression initiale et finale de ce programme.
- Si le nombre de lames à immunocolorer n'atteint pas la capacité du panier, utilisez des lames propres et vierges pour occuper les positions vides. Une fois le programme terminé, laissez le retour passif de la chambre à la pression ambiante (au moins 30 min).
note: Des durées plus longues peuvent réduire les taches de fond non spécifiques.
- Transférez délicatement le panier coulissant dans un récipient de coloration en acier inoxydable rempli d’eau distillée pendant 5 min.
4. Inactivation de la peroxydase endogène
- Plongez le panier à lames contenant les sections d’échantillon dans un bain de peroxyde d’hydrogène à 3 % (H, 2, O, 2) dans du méthanol pendant 30 min. Rincez les sections à l’eau courante (5 min). Égouttez et immergez les sections dans 1 solution saline tamponnée au Tris (TBS) pendant 5 minutes supplémentaires.
5. Immunodétection
REMARQUE : Pour la présente étude, l’immunodétection a été réalisée à l’aide du format de l’espace capillaire à l’aide d’un système d’assemblage de clips de lames disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). D’autres systèmes de lames d’immunohistochimie sont également applicables.
- Placez chaque diapositive sur un support de plaque de recouvrement disponible dans le commerce (voir la table des matériaux) pré-humidifié avec du TBS, en évitant les bulles, le côté du tissu faisant face au support et les bords de la glissière coïncidant avec les deux points inférieurs du support.
- Tenez l’ensemble porte-diapositive entre le pouce et l’index, avec un doigt sur le dessus de la lame d’échantillon et l’autre sur le bas du support. Ensuite, placez l’ensemble dans la galerie du système.
- Pour s’assurer que l’ensemble est bien assemblé, remplissez le puits entre la lame d’échantillon et le support avec du TBS, qui ne doit pas déborder immédiatement. À partir de ce moment, assurez-vous qu’environ 80 μL de TBS doivent être retenus entre le support et la lame. Ne laissez pas les sections sécher.
- Une fois dans le système, pour diminuer la coloration de fond avant le traitement par anticorps primaire (anticorps contre les protéines prions (anti-PrP), voir le tableau des matériaux), pré-incubez les lames d’échantillon avec 20 % de sérum normal de la même espèce que l’anticorps secondaire hôte utilisé pour l’immunocoloration (dans le cas présent, sérum de cheval) pendant 30 min dans le TBS.
- Décongeler le nombre d’aliquotes d’anticorps à utiliser en fonction de l’espèce animale analysée, le nombre de sections d’échantillon à examiner et la quantité de dilution de travail.
note: Pour de meilleurs résultats, utilisez 10 % de sérum normal de la même espèce que la source des solutions d’anticorps secondaires et d’anticorps primaires. Si possible, pour de meilleurs résultats, la source hôte du sérum normal et de l’anticorps secondaire doit provenir de la même espèce.
- Sans laver les sections, appliquez directement la solution d’anticorps primaires (200 μL) dans chaque puits du porte-lames et incubez pendant 60 min à température ambiante.
- Pour le lavage, remplissez les puits des ensembles de porte-diapositives avec du TBS et attendez 5 min. Répétez deux fois.
- Diluer l’anticorps secondaire biotinylé (anticorps monoclonal anti-murin Horse Ab, voir tableau des matériaux) à 1/200 dans du TBS avec 10 % de sérum de cheval. Préparez le volume requis en fonction du nombre de sections à traiter.
- Appliquez la solution d’anticorps secondaire (200 μL) dans chaque puits du porte-lames. Incuber 30 min à température ambiante.
- Lavez comme décrit à l’étape 5.5.
- Pour l’incubation avec le complexe avidine-biotine peroxydase (complexe ABC/HRP, voir Tableau des matériaux), préparer le réactif 30 min avant utilisation. Appliquez la solution complexe ABC/HRP (200 μL) dans chaque puits du jeu de supports de plaques coulissantes. Incuber 30 min à température ambiante.
- Lavez comme décrit à l’étape 5.5.
6. Développement avec le chromogène 3,3' diaminobenzidine (DAB)
ATTENTION : Le DAB est un cancérogène potentiel. Par conséquent, des soins appropriés sont nécessaires lors de l’utilisation de ce réactif, y compris une protection oculaire, des blouses de laboratoire, des gants et de bonnes procédures de laboratoire. Éliminez-les conformément aux réglementations locales.
- Diluer le chromogène selon les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux) immédiatement avant utilisation. Appliquez la solution chromogène (400 μL) dans chaque puits de l’ensemble de plaques coulissantes.
- Incuber jusqu’à 30 min à température ambiante. Dans les sections positives à la PrPSc (isoforme anormale des protéines prions), une période d’incubation de 10 minutes est généralement suffisante.
- Éliminez la solution chromogène résiduelle en lavant les lames dans de l’eau distillée. Retirez les lames des supports de plaque de recouvrement et placez-les dans un récipient en plastique avec de l’eau distillée.