Technique de détection de souches cyanobactériennes à l’aide d’une puce à microréseau d’anticorps

Résumé

Source : Blanco, Y. et al., Protocole expérimental de détection des cyanobactéries dans des échantillons liquides et solides à l’aide d’une puce à microréseau d’anticorps.J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo présente une méthode pour détecter les souches cyanobactériennes dans un échantillon environnemental à l’aide d’une puce à microréseaux d’anticorps. Les échantillons porteurs de diverses bactéries interagissent avec les anticorps imprimés, et l’immunomarquage avec des anticorps anti-cyanobactéries marqués au fluorophore révèle la présence de souches cyanobactériennes spécifiques par fluorescence à des endroits distincts.

Protocole

1. Préparation des immunogènes

1. Cultiver chaque souche cyanobactérienne dans le milieu de culture correspondant dans les conditions décrites au tableau 1.
   REMARQUE : Le milieu de croissance et les conditions de culture de chaque souche de cyanobactéries sont indiqués dans le tableau 1. Toutes les souches de cyanobactéries, à l'exception de K17, appartiennent au groupe d'Antonio Quesada de l'Université Autonoma (Madrid, Espagne). L’anticorps contre Planktothrix rubescens a été généré à partir d’un échantillon naturel de la prolifération monospécifique de cette cyanobactérie du réservoir de Vilasouto (nord de l’Espagne).
2. Quantifier le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules par microscopie optique pour obtenir environ 10⁸ cellules/mL à partir d’une culture en phase de croissance exponentielle tardive ou stationnaire.
3. Récolter les cellules de 5 mL de culture par centrifugation à 2 000 x g pendant 5 min.
4. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un tube de 10 ml avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (1 x PBS) pour obtenir environ 10^{à 8} cellules/mL.
5. Homogénéiser et lyser les cellules de la suspension par sonication pendant 5 cycles de 30 s chacun, avec une pause de 30 à 60 s sur glace, à l’aide d’un processeur à ultrasons portable ou en plongeant le tube dans le bain d’eau d’un perturbateur cellulaire à l’amplitude maximale (30 kHz).
6. Répéter les étapes 1.3 à 1.5 pour chaque souche de cyanobactérie.
   REMARQUE : La sonication produit une perturbation cellulaire et la libération de contenu cellulaire. Bien que les protéines et les polysaccharides soient de bons immunogènes, des molécules spécifiques, telles que les lipides et les acides nucléiques, n’induisent pas de réponse immunogène humorale par elles-mêmes. Par conséquent, ils doivent se lier à des supports, tels que des polysaccharides ou des protéines, pour augmenter la complexité moléculaire. De plus, la sonication libère du matériel intracellulaire qui peut déclencher la production d’anticorps.

2. Production d’anticorps polyclonaux

1. Préparez la première dose d'immunogène en mélangeant 0,5 mL du lysat cellulaire ultrasonique obtenu à l'étape 1.5 avec 0,5 mL d'adjuvant de Freund complet. Livrez-le à l’exploitant d’une animalerie pour la production d’anticorps polyclonaux de lapin.
2. Préparez trois doses supplémentaires comme précédemment pour une utilisation ultérieure comme stimulateurs de mémoire dans le processus de production d'anticorps en mélangeant 0,5 mL du même homogénat/lysat obtenu à l'étape 1.5 avec 0,5 mL d'adjuvant de Freund incomplet. Donnez-les à l’animalerie pour accomplir le processus de production d’anticorps.
3. Répétez les étapes 2.1 et 2.2 pour chaque nouveau procédé de production d’anticorps.
   REMARQUE : Normalement, la production d’anticorps est confiée à des installations ou à des entreprises spécialisées dans le domaine de l’élevage, car une licence et une formation appropriées sont nécessaires pour travailler avec des animaux. Les sociétés fournissent un test ELISA (Relative Enzyme-Linked Immunosorbent Test) mesurant la quantité d’anticorps spécifiques de l’antigène présents dans l’échantillon de sérum.

3. Purification des anticorps

1. Purifier la fraction d’immunoglobuline G (IgG) du sérum immunitaire et pré-immunitaire prélevé à l’étape 2 par chromatographie d’affinité protéine-A. Certains kits de purification commerciaux, basés sur des systèmes de cartouches, fonctionnent bien ; Suivez les instructions du fournisseur.
2. Lorsque le kit de purification ne fournit pas de système de dessalage, changer le tampon après l’élution des anticorps purifiés à 0,1x PBS, soit par dialyse, soit en utilisant des dispositifs de filtration centrifuge avec une taille de pores de membrane de 100 kDa (ou moins).
3. Déterminez la concentration d’anticorps en mesurant l’absorbance à 280 nm ou en utilisant des méthodes colorimétriques, telles que Bradford, Lowry ou l’acide bicchoninique (BCA).
   REMARQUE : Il est important d’éviter d’inclure des groupes amines dans le tampon d’élution (par exemple, les tampons Tris) car ils entrent en compétition avec l’anticorps pour la liaison aux surfaces solides activées par des groupes époxy. Après la purification, il est important de tester l’activité des anticorps avec ELISA.

4. Marquage des anticorps à fluorescence

1. Étiqueter les anticorps purifiés obtenus dans la section 3 avec un fluorochrome (par exemple, un colorant fluorescent rouge lointain) en dissolvant un flacon commercial contenant un colorant pour le marquage de 1 mg de protéine dans 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Ajouter 2 μL de colorant dissous à chaque préparation d’anticorps à une concentration de 2 mg/mL dans un volume final de 50 μL dans une solution saline tamponnée au phosphate de 50 mM (pH 8,5).
2. Maintenir les réactions d’étiquetage sous agitation continue pendant 1 h à température ambiante et 1 200 tr/min sur une plate-forme vibrante.
3. Purifier les anticorps marqués par chromatographie d’exclusion stérique (p. ex., à l’aide d’un gel dont la plage de fractionnement est comprise entre 1,5 et 30 kDa piégé dans une colonne), en suivant les recommandations du fournisseur.
4. Mesurez l’absorbance à 280 nm et à 650 nm dans les éluats et calculez l’efficacité de l’étiquetage en suivant les recommandations du fournisseur.
   REMARQUE : Jusqu’à 50 réactions de marquage d’anticorps de 50 μL peuvent être effectuées avec un seul flacon de colorant fluorescent pour marquer 1 mg de protéine. Il est recommandé de recouvrir les tubes d’une feuille d’aluminium ou, alternativement, d’utiliser des tubes opaques de 0,5 ml pour éviter les processus de trempe après l’étape 4.3. Pour les anticorps IgG, le marquage optimal est obtenu avec 3 à 7 moles de colorant par molaire d’anticorps.

5. Production de CYANOCHIP

1. Anticorps et contrôles dans la solution d’impression
   1. Préparez 30 μL de chaque anticorps purifié dans une solution d’impression en mélangeant chaque anticorps à 1 mg/mL dans un tampon d’impression protéique commercial 1x avec 0,01 % (v/v) de Tween 20 (un détergent non ionique), le tout sous forme de concentrations finales.
      REMARQUE : Alternativement, une solution d’anticorps peut contenir 20 % de glycérol, 1 % (p/v) de saccharose (ou de tréhalose, comme agent de conservation) et 0,01 % (v/v) de Tween 20 dans un tampon carbonaté (pH 8,5).
   2. Préparez 30 μL de la solution d’impression comme témoins : (a) 1 tampon d’impression protéique avec 0,01 % (v/v) Tween 20, (b) sérum pré-immun purifié protéine-A à 1 mg/mL dans 1 tampon d’impression protéique avec 0,01 % (v/v) Tween 20, et (c) albumine sérique bovine (BSA) à 1 mg/mL dans 1 tampon d’impression protéique avec 0,01 % (v/v) Tween 20.
   3. Préparez 30 μL d’un sérum pré-immun purifié marqué par fluorescence à différentes concentrations (par exemple, de 50 μg/mL à 1 μg/mL) dans 1 tampon d’impression protéique avec Tween 20, comme à l’étape 5.1.1. Ces échantillons seront utilisés comme marqueurs de cadre fluorescent et pour la quantification de la fluorescence relative après le repérage.
   4. Ajoutez 30 μL par puits des solutions d’impression préparées aux étapes 5.1.1, 5.1.2 et 5.1.3 aux microplaques à 384 puits de la plus haute qualité pour la fabrication de microréseaux, tels que le polypropylène.
      REMARQUE : Le tampon d’impression de protéines augmente la qualité et la stabilité des anticorps, et Tween 20 homogénéise la morphologie des taches et construit le couplage des protéines. Il est recommandé de maintenir la microplaque à 384 puits à 4 °C avant de l’utiliser. Conservez-le à -20 °C pendant de longues périodes. Le polypropylène a une faible teneur en ADN, en protéines, en extrait cellulaire et en liaison intrinsèque à de petites molécules.
2. Impression d’anticorps sur une lame de microscope
   REMARQUE : Imprimez les anticorps sur des lames de microscope activées à l’aide de différentes plates-formes de réseau, telles que des dispositifs avec contact, à aiguille fendue ou sans contact, tels que des imprimantes piézoélectriques ou des technologies à jet d’encre. Dans ce travail, la CYANOCHIP a été imprimée en routine par contact à l’aide d’un système robotique (arrayer) capable de repérer les quantités nL des anticorps à l’échelle μm.
   1. Réglez les conditions environnementales de la salle d’impression sur 20 °C et 40 à 50 % d’humidité relative.
   2. Installez les substrats des lames (par exemple, des lames de microscope en verre activé par l’époxy de 75 x 25 mm) de manière à effectuer plusieurs réseaux d’anticorps identiques sur chaque lame.
   3. Repérez chaque anticorps purifié, y compris les témoins et le cadre de référence, en trois points ; dans ces conditions, les taches ont un diamètre de 180 à 200 m.
   4. Après l’impression, laissez les lames pendant au moins 30 min à température ambiante pour les laisser sécher, puis stockez-les à 4 °C ; pour le travail sur le terrain, les lames peuvent être transportées et stockées à température ambiante pendant plusieurs mois.
      REMARQUE : La CYANOCHIP est imprimée dans un format de micropuce en trois exemplaires avec 3 x 8 puces identiques par lame ou 9 matrices identiques dans un format de 1 x 9 puces. La taille de chaque réseau ne doit pas être supérieure aux dimensions de la chambre de réaction pour un joint à 24 puits (généralement 7,5 x 6,5 mm dans une chambre d’hybridation 3 x 8).
   5. Avant d’utiliser la puce pour analyser des échantillons environnementaux, utilisez le dosage immunologique à microréseau sandwich fluorescent (FSMI) pour déterminer la dilution de travail de chaque anticorps dans une courbe de titrage. Pour chaque anticorps, utilisez une concentration standard de l’immunogène correspondant (10³ - 10^{4 cellules}/mL) et des dilutions en série de l’anticorps fluorescent (entre 1:500 et 1:32 000). La concentration optimale en anticorps correspond à 50 % de l’intensité maximale du signal obtenue dans la courbe de titrage. De plus, la sensibilité et la spécificité de chaque anticorps doivent être déterminées, comme décrit dans Blanco et al.

6. Préparation d’extraits environnementaux multianalytes pour l’immunodosage par microréseau sandwich fluorescent (FSMI)

1. Extrait multianalyte d’un échantillon liquide
   1. Prélever 1 à 100 mL de l’échantillon liquide à l’aide d’une seringue stérile (p. ex., de l’eau provenant de la rive d’un réservoir d’eau) ; la quantité d’échantillon dépend grandement de la concentration potentielle des cibles.
   2. Concentrez les cellules en faisant passer l’échantillon d’eau à travers un filtre en polycarbonate de 3 μm de diamètre et de 47 m ; une concentration cellulaire comprise entre 10³ et 10⁸ cellules/mL est souhaitable pour une détection positive, mais la concentration réelle est inconnue.
   3. Récupérez la biomasse recueillie dans le filtre avec 1 mL d’une solution saline modifiée tamponnée Tris, tampon renforcé de Tween 20 (TBSTRR ; 0,4 M de Tris-HCl (pH 8), 0,3 M de NaCl et 0,1 % de Tween 20) en la grattant à l’aide d’une spatule dans un tube de 15 mL.
   4. Homogénéiser et désagréger à l’aide d’un processeur à ultrasons portatif, comme décrit à l’étape 1.5, ou simplement en pipetant de haut en bas plusieurs fois, ce qui prépare l’échantillon pour l’analyse par la puce à rayonnement.
2. Extrait multianalyte à partir d’un échantillon solide
   1. Pesez jusqu’à 0,5 g de l’échantillon solide (p. ex. roche, sol ou sédiments) dans un tube de 10 mL et ajoutez jusqu’à 2 mL de TBSTRR.
   2. Sonicate en immergeant la sonde du sonicateur dans le tube, en plongeant le tube dans le bain-marie d’un puissant pavillon de sonicateur ou en utilisant un sonicateur portatif. Effectuer au moins 5 cycles de 30 s à 30 kHz, en s’arrêtant pendant 30 s sur la glace.
   3. Filtre pour enlever le sable, l’argile et d’autres matériaux grossiers à l’aide d’une seringue de 10 ml couplée à un porte-filtre en nylon de 10 à 12 mm de diamètre et de pores de 5 à 20 μm. Poussez l’échantillon à travers le filtre dans un tube de 1,5 ml. Si le filtre sature, agitez la suspension dans la seringue et amenez-la à une nouvelle ; Cela prépare le matériel filtrat pour l’immunodosage (étape 7).
      REMARQUE : La capacité de mise en mémoire tampon de TBSTRR dépend du type d’échantillon. Il est important d’effectuer l’immunodosage immédiatement après la préparation de l’extrait environnemental pour éviter l’effet de la dégradation enzymatique sur les analytes. Vous pouvez également ajouter des inhibiteurs de protéase dans l’extrait environnemental et congeler à -80 °C jusqu’à l’étape suivante.

7. Dosage immunologique par microréseau sandwich fluorescent (FSMI)

1. Blocage de la puce CYANOCHIP
   REMARQUE : Immédiatement avant l’utilisation, traitez les lames imprimées pour bloquer tous les groupes époxy libres sur la lame et pour éliminer l’excès d’anticorps non liés de manière covalente.
   1. Immerger la micropuce dans une solution de Tris-HCl à 0,5 M (pH 9) avec une solution de BSA à 5 % (p/v) sur une surface propre (p. ex., une boîte de Pétri ou un tube de 50 mL) en l’agitant doucement à partir d’une plate-forme à bascule pendant 5 min. Vous pouvez également déposer la lame sur une goutte de 100 à 200 μL de la solution ci-dessus, avec les points de la micropuce face à elle. Laisser reposer 3 à 5 minutes, puis continuer.
   2. Ramassez délicatement la lame à l’aide d’une pince à pointe de plastique ; essayez d’éviter de toucher les zones de la puce à microréseau. Éliminez l’excès de liquide en faisant tomber doucement la glissière sur une serviette en papier. Immergez-le dans 0,5 M de Tris-HCl (pH 8) avec une solution BSA à 2 % (p/v) pendant 30 min avec une légère agitation à partir d’une plate-forme à bascule.
   3. Séchez la lame en effectuant une courte centrifugation (200 - 300 x g pendant 1 min) à l’aide d’une microcentrifugeuse commerciale adaptée aux lames de microscope. Vous pouvez également sécher la diapositive en la frappant doucement sur une serviette en papier.
2. Incubation de l’extrait d’échantillon multianalyte avec la puce à ADN
   1. Installez la lame dans une cassette d’hybridation de microréseaux commerciaux avec 24 puits pour plusieurs microréseaux ; suivez les instructions du fournisseur.
   2. Après l’assemblage de la lame et de la cassette, pipeter jusqu’à 50 μL de l’extrait de l’échantillon ou une dilution de celui-ci dans TBSTRR dans chaque puits de la cassette.
   3. Répétez l’étape 7.2.2 pour chaque échantillon à analyser.
   4. En guise de commande à blanc, pipetez 50 μL de tampon TBSTRR dans au moins deux puits séparés de la cassette.
   5. Incuber à température ambiante pendant 1 h avec mélange en pipetant toutes les 15 min ou en le laissant sous agitation douce. Vous pouvez également incuber pendant 12 h à 4 °C
      REMARQUE : Utilisez d’autres joints d’incubation en fonction du motif de la puce à ADN. Le temps et la température de l’incubation à l’étape 7.2.5 sont des paramètres empiriques qui dépendent normalement de l’affinité et de la cinétique de liaison de chaque appariement antigène-anticorps.
3. lavage
   1. Retirez les échantillons en posant la cassette et en la frappant soigneusement sur un papier propre et absorbant.
   2. Lavez les puits en ajoutant 150 μL de TBSTRR à chacun d’eux, et éliminez le tampon, comme ci-dessus.
   3. Répétez l’étape 7.3.2 trois fois de plus.
4. Incubation avec des anticorps détecteurs fluorescents
   1. Ajouter 50 μL d’un mélange d’anticorps contenant les 17 anticorps anti-cyanobactéries de la souche, chacun marqué avec le fluorochrome dans TBSTRR avec 1 % (p/v) BSA. Déterminer la concentration de chaque anticorps fluorescent dans le mélange (de 0,7 à 2 μg/mL) en effectuant des expériences de titrage de chaque paire antigène/anticorps.
   2. Incuber pendant 1 h à température ambiante, comme décrit à l’étape 7.2.5, ou pendant 12 h à 4 °C.
5. Lavage des anticorps fluorescents
   1. Retirez les anticorps fluorescents non liés, comme à l’étape 7.3.
   2. Démontez la cassette et plongez la lame dans du PBS 0,1x (par exemple, dans un tube de 50 ml) pour un rinçage rapide.
   3. Séchez la lame comme à l’étape 7.1.3.

8. Recherche de fluorescence

1. Scannez la lame à la recherche de fluorescence au pic de fluorescence d’émission maximale pour le colorant fluorescent rouge lointain dans un scanner pour la fluorescence. Prenez plusieurs images des microréseaux avec différents paramètres de balayage, généralement en abaissant la valeur de gain laser.
   note: Évitez les taches saturées (> 65 000 fluorescences) - elles sont hors échelle et peuvent introduire des erreurs de quantification.

Tableau 1. Liste des anticorps (Abs) et des souches cyanobactériennes utilisées pour produire la CYANOCHIP.

Code Ab	Immunogène (souche)	commande	habitat	Douleur moyenne	Conditions de culture
K1	Anabaena sp.	Nostocales	inconnu	BG11 et nitrate	30 ºC, lumière continue
K2	Anabaena sp.	Nostocales	inconnu	BG11o	30 ºC, lumière continue
K3	Microcystis flosaquae	Chroococcales	Planctoniques	BG11	28 ºC, lumière continue
K4	Microcystis novacekii	Chroococcales	Planctoniques	BG11	28 ºC, lumière continue
K5	Microcystis aeruginosa	Chroococcales	Planctoniques	BG11	28 ºC, lumière continue
K6	Aphanizomenon ovalisporum	Nostocales	Planctoniques	BG11o	28 ºC, lumière continue
K7	Phormidium sp.	Oscillatoriales	benthique	BG11	18 ºC, photopériode 16-8
K8	Rivularia sp.	Nostocales	benthique	CHU-D	18 ºC, photopériode 16-8
K9	Chamaesiphon sp.	Chroococcales	benthique	BG11	18 ºC, photopériode 16-8
K10	Leptolyngbya boryana	Oscillatoriales	benthique	BG11	18 ºC, photopériode 16-8
K11	Tolypothrix distorta	Nostocales	benthique	BG11o	18 ºC, photopériode 16-8
K12	Aphanizomenon aphanizomenoides	Nostocales	Planctoniques	BG11o	28 ºC, lumière continue
K13	Nostoc sp. (Antarctique)	Nostocales	benthique	BG11o	13 ºC, photopériode 16-8
K14	Anabaena sp.	Nostocales	benthique	BG11o	13 ºC, photopériode 16-8
K15	Leptolyngbya sp.	Oscillatoriales	benthique	BG11	13 ºC, photopériode 16-8
K16	Tolypothrix sp.	Nostocales	benthique	BG11	13 ºC, photopériode 16-8
K17	Planctothrix rubescens	Oscillatoriales	Planctoniques	aucun	aucun

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtres à pores de 0,22 mm de diamètre	Millipore	GSWP04700	Pour la préparation d’immunogènes
Microcentrifugeuse Eppendorf 5424R	Fisher Scientific		Pour la préparation d’immunogènes
Tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 (10X)	Thermofisher Scientific	70011036	50 mM de phosphate de potassium, 150 mM de NaCl, pH 7,4
Processeur à ultrasons UP50H	Hielscher		Pour la préparation d’immunogènes
Adjuvant de Freund complet	Sigma-Aldrich	Réf. F5881	Immunopotentialisateur
L'adjuvant incomplet de Freud	Sigma-Aldrich	F5506	Pour les injections de rappel
Kit de purification d’anticorps de protéine A	Sigma-Aldrich	PURE1A	Pour l’isolement des IgG
Appareils de filtration centrifuge MWCO<100 KDa	Millipore	UFC510096-96K	Pour l’isolement des IgG
Tubes de dialyse benzoylés	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	Pour l’isolement des IgG
Colonnes Illustra Microspin G-50	GE-Soins de santé	GE27-5330-02	Pour l’isolement des IgG
Réactif Bradford	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	Pour quantifier la concentration d’anticorps
Kit de dosage des protéines MicroBCA	Thermo Scientific	Référence 23235	Pour quantifier la concentration d’anticorps
Tampon de mise en réseau de protéines 2X	Whatman (Sigma Aldrich)	Réf. S00537	Tampon d’impression ; 30-40 % de glycérol dans 1X PBS avec 0,01 % de Tween 20
Préadolescent 20	Sigma-Aldrich	Réf. P9416	Détergent non ionique
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Contrôle de l’impression, réactif de blocage
Microplaque à 384 puits	Genetix	X6004	Pour l’impression d’anticorps
Robot arrayer pour plusieurs diapositives	Arrayer MicroGrid II TAS de Digilab		Pour l’impression d’anticorps
Lames de verre à substrat époxy	Arrayit corporation	VEPO25C	Support solide pour l’impression d’anticorps
Alexa Fluor-647 Ester de succinimidyle	Sondes moléculaires	A20006	Fluorochrome
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	Dissolvant fluorochrome
Vibrateur à plate-forme vibrante Heidolph Titramax	Fisher Scientific		Pour le marquage des anticorps
Colonnes Illustra Microspin G-50	Santé	Référence : 27-5330-01	Pour la purification des anticorps marqués
Tubes bruns de 0,5 ml	Sarstedt	7,27,04,001	Pour le stockage des anticorps marqués
Spectrophotomètre Nanodrop 1000	Thermo Scientific		Quantifier la concentration d’anticorps et l’efficacité du marquage
Filtre en polycarbonate de 3 μm de diamètre 47 mm	Millipore	TMTP04700	Pour concentrer les cellules
1M de solution de chlorhydrate de Trizma pH 8	Sigma-Aldrich	Réf. T3038	Pour la préparation TBSTRR ; pour bloquer les diapositives
chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	Réf. S7653	Pour la préparation TBSTRR
Filtres en nylon de 20 μm	Millipore	NY2004700	Pour la préparation d’extraits environnementaux
Porte-filtres de 10-12 mm	Millipore	SX0001300	Pour la préparation d’extraits environnementaux
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Sigma-Aldrich	Réf. P8340	Pour le stockage d’extraits environnementaux
1M de solution de chlorhydrate de Trizma pH 9	Sigma-Aldrich	Réf. T2819	Pour bloquer des diapositives
Heidolph Duomax 1030 secoueur à plate-forme basculante	VWR		Pour bloquer les lames ; pour les processus d’incubation
Microcentrifugeuse VWR Galaxy miniarray	VWR	C1403-VWR	Pour sécher les lames
Cassette d’hybridation de microréseaux multipuits	Arrayit corporation	AHC1X24	Cassette pour 24 dosages par lame
Scanner de microréseaux GenePix 4100A	Dispositifs moléculaires		Scanner pour fluorescence
Logiciel GenePix Pro	Dispositifs moléculaires		Logiciel d’analyse et de quantification d’images