Immunomarquage de cellules encapsulées dans un système d’hydrogel 3D

Résumé

Source : LeSavage, B. L., et al. Production d’hydrogels de protéines de type élastine pour l’encapsulation et l’immunocoloration des cellules en 3D. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre une technique d’immunocoloration de cellules encapsulées dans un hydrogel 3D. La culture d’hydrogel contenant des cellules progénitrices neurales est fixée, perméabilisée et traitée avec une solution bloquante pour éviter l’immunocoloration non spécifique. Un cocktail d’anticorps primaires est ajouté pour lier des protéines spécifiques, suivi d’anticorps secondaires marqués par fluorescence et d’une coloration nucléaire. L’échantillon est ensuite monté sur une lame et observé au microscope confocal.

Protocole

1. Encapsulation cellulaire dans des hydrogels 3D de protéines de type élastine (ELP)

1. Préparation des moules en silicone
   1. À l’aide d’un poinçon de biopsie du diamètre souhaité, créez des trous dans une feuille de silicone de 0,5 mm d’épaisseur et découpez un carré autour de chaque trou. Répétez l’opération pour le nombre de moules souhaité.
      REMARQUE : Le diamètre et l’épaisseur des moules peuvent être ajustés pour l’application particulière et les conditions de culture cellulaire. En pratique, pour les cultures cellulaires de 50 x 10⁶ cellules/mL, des moules de 0,5 mm d’épaisseur avec des diamètres de 4 mm et 5 mm sont recommandés pour une extraction suffisante de l’ADN/ARN et des protéines, respectivement. Pour l’immunomarquage, un poinçon de biopsie de 2 mm peut être utilisé pour créer à la place trois trous adjacents par moule carré afin que trois répétitions puissent être colorées par puits.
   2. Retirez la pellicule plastique de chaque côté du moule individuel à l’aide d’une pince à épiler.
      note: Évitez tout contact avec la surface en silicone exposée, car la contamination peut diminuer l’efficacité future de la liaison plasma.
   3. À l’aide d’une pince à épiler, disposer le même nombre de moules en silicone nu et de lamelles en verre (n° 1, 12 mm de diamètre) en rangées alternées sur le couvercle inversé d’une plaque à 48 puits. Une fois terminé, couvrez le couvercle de la plaque à 48 puits pour éviter toute contamination.
   4. Le plasma d’oxygène traite l’ensemble du couvercle de la plaque à 48 puits (c’est-à-dire les moules et les lames de verre). Immédiatement après, utilisez une pince pour retourner le moule en silicone sur la lamelle en verre adjacente. Appuyez fermement sur le moule pour assurer l’adhérence. Laissez incuber les moules à température ambiante pendant 1 h
      note: La durée du traitement au plasma d’oxygène variera en fonction de l’instrument utilisé. Les conditions typiques de notre instrument sont une fenêtre de pression de gaz de fonctionnement comprise entre 0,3 et 4 mbar, un débit d’oxygène gazeux de 20 cm³/min et une exposition de l’échantillon au plasma pendant 10 à 20 s.
   5. Stériliser les moules par autoclavage. Conservez les moules à température ambiante dans un environnement stérile jusqu’à utilisation.
      note: Les moules peuvent être stockés à ce stade indéfiniment.
2. Préparation d’une solution mère de protéines de type élastine
   1. Retirer l’ELP lyophilisé d’un stockage à 4 °C. Réchauffez la protéine à température ambiante avant d’ouvrir le tube pour vous assurer qu’aucune condensation ne s’accumule sur la protéine lors d’une utilisation répétée.
   2. Dissoudre l'ELP dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) à 4 °C en agitant constamment (c.-à-d. en essorant) pendant la nuit><. note: La concentration de la solution mère ELP sera encore diluée avec l’ajout d’une solution de réticulation à un rapport volumétrique défini par l’utilisateur. Par exemple, pour une concentration finale de 3 % (p/v) de PEL, préparer une solution mère de PEL à 3,75 % (p/v) qui sera diluée à un rapport volumétrique de 4:1 entre la solution ELP et la solution de réticulation. Ajustez la concentration au besoin pour l’application souhaitée.
   3. Filtre stérile : solution mère ELP à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm. Conservez ELP sur de la glace lorsqu’il n’est pas utilisé.
3. Dans l’enceinte de biosécurité, transférez les moules stériles à l’aide d’une pince à épiler stérile dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits.
4. Préparation de la solution mère de chlorure de tétrakis(hydroxyméthyl)phosphonium (THPC)
   1. Diluer le THPC dans le DPBS juste avant l’utilisation. Ajustez la concentration de la solution de THPC en fonction de la concentration finale de l’ELP et du rapport de réticulation souhaité.
      note: Pour le protocole, une concentration finale de PEL de 3 % (p/v) sera obtenue en mélangeant la solution mère de l’ELP avec la solution de THPC dans un rapport volumétrique de 4:1. Ajustez si nécessaire.
   2. Ajouter 2,6 μL de solution de THPC (80 % dans l’eau) à 997,4 μL de DPBS.
      note: Cette concentration de THPC correspond à un rapport stœchiométrique de 1:1 des groupes hydroxyméthyle sur le THPC et des amines primaires sur la protéine ELP lors du mélange de solutions au rapport volumétrique 4:1 décrit pour un hydrogel ELP final de 3 % (p/v). La solution de THPC est visqueuse et les gouttelettes de solution peuvent coller sur le côté de la pointe de la pipette. Pour des concentrations précises, évitez de telles gouttelettes lors de la dilution dans du DPBS. Purgez le récipient de stock de THPC avec de l’azote gazeux pour éviter l’oxydation de la phosphine et l’inactivation de l’agent de réticulation.
   3. Vortex la solution à mélanger et à garder sur la glace.
   4. Filtrez stérilement la solution mère de THPC à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm. Diluer davantage la solution mère de THPC avec du DPBS stérile pour obtenir des rapports de réticulation stœchiométriques plus faibles (par exemple, 0,5:1 ou 0,75:1).
      note: Le THPC est sensible à l’oxygène et la solution diluée doit être utilisée quelques heures après la préparation.
5. Dissociez les cellules par incubation avec de la trypsine-EDTA dans une suspension unicellulaire, granulez les cellules et comptez les cellules remises en suspension dans le milieu à l’aide d’un hémocytomètre.
   note: Les protocoles exacts pour cette étape dépendront fortement du type de cellule et de l’application souhaités. Pour les cellules progénitrices neurales utilisées tout au long de ce protocole, une incubation de trypsine-EDTA à 0,025 % à température ambiante pendant 1,5 min a été réalisée. Les cellules ont été granulées à 200 x g pendant 2 min. Pour augmenter la viabilité cellulaire, les cellules doivent être suspendues dans des conditions normales de milieu. Les densités cellulaires typiques utilisées pour l’encapsulation cellulaire vont de 1 à 50 x 10⁶ cellules/mL de volume final d’hydrogel. Ajustez si nécessaire.
6. Aliquote le nombre souhaité de cellules dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml.
7. Centrifugez les cellules à ~200 x g pendant 3 min. Soigneusement, aspirez le surnageant et maintenez la pastille cellulaire sur de la glace.
   note: Il est essentiel d’aspirer complètement tout le surnageant pour atténuer la dilution supplémentaire de l’agent de réticulation ELP et THPC. Les vitesses de centrifugation spécifiques varient selon le type de cellule.
8. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans la solution mère ELP de sorte que le volume soit égal à 80 % du volume final (en supposant un rapport de 4:1 entre la solution ELP et la solution THPC). Mélangez 20 à 25 fois à la pipette pour produire un mélange homogène des cellules et de ELP.
   note: Évitez de saisir le bas du tube pour atténuer l’augmentation de la température et la transition de phase ultérieure de l’ELP. Chaque moule de 2 mm avec trois répétitions nécessite 7,5 μL de volume final (c’est-à-dire 6 μL de solution mère ELP et 1,5 μL de solution mère de THPC) divisés également dans les 3 trous (c’est-à-dire 2,5 μL de volume final par trou). Pour les moules de 4 et 5 mm, un volume final de 7,5 μL et 15,5 μL est nécessaire, respectivement.
9. Ajouter la solution mère de THPC à la suspension cellule/ELP pour les 20 % restants du volume final. Mélangez à la pipette 20 à 25 fois pour obtenir un mélange homogène.
10. Pipetez immédiatement les volumes finaux correspondants du mélange cellule/ELP/THPC dans chaque moule par un mouvement circulaire. Répétez l’opération pour tous les moules.
11. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 min, suivi d’une incubation supplémentaire à 37 °C pendant 15 min
    note: La première période d'incubation permettra de faciliter la réticulation initiale de l'hydrogel avant d'augmenter la température au-dessus de la température critique inférieure de la solution (LCST) de l'ELP et d'induire sa ségrégation de phase thermique.
12. Ajouter lentement 750 μL de milieu de culture cellulaire chaud dans chaque puits de la plaque à 24 puits, en évitant de perturber les gels.
13. Incuber les hydrogels à 37 °C pendant 7 jours.
    note: Il est recommandé de changer complètement le milieu tous les 1 à 2 jours selon le type de cellule. Pour limiter le stress sur le gel, utilisez une pipette Pasteur en verre munie d’une pointe de pipette de 200 μL lors de l’aspiration du milieu à partir du puits.

2. Immunocytochimie des cellules dans les hydrogels ELP 3D

1. Préparez la solution de fixation en mélangeant 10 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 16 % (p/v) dans 30 mL de DPBS. Réchauffez la solution à 37 °C.
2. Aspirez le milieu de la plaque à 24 puits et lavez-le délicatement avec 1 mL de DPBS.
3. Ajouter 750 μL de la solution de fixation dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 30 min. N’utilisez pas l’incubateur de culture tissulaire pour éviter de contaminer d’autres cultures avec des vapeurs de PFA.
4. Aspirez soigneusement la solution de fixation de chaque puits, en jetant le PFA dans un conteneur de déchets dangereux approprié.
   prudence: L’exposition au PFA peut provoquer une irritation de la peau et des yeux. Portez des gants ou des lunettes de sécurité et travaillez dans une hotte chimique.
5. Ajouter 1 mL de DPBS à chaque échantillon. Aspirez immédiatement le DPBS et jetez-le dans le conteneur à déchets PFA.
6. Lavez les échantillons deux fois avec 1 mL de DPBS pendant 10 min chacun.
   note: Les échantillons peuvent être stockés dans DPBS à 4 °C jusqu’à une semaine après le scellement de la plaque avec Parafilm.
7. Perméabiliser chaque échantillon avec 750 μL de solution de perméabilisation (100 mL de DPBS et 0,25 mL de Triton X-100 ; PBST) pendant 1 h à température ambiante sur une bascule à 15 tr/min.
8. Aspirer le PBST et ajouter 750 μL de solution bloquante (95 ml de PBS, 5 g d’albumine sérique bovine, 5 ml de sérum et 0,5 ml de Triton X-100) à chaque échantillon. Incuber à température ambiante pendant 3 h sur une bascule à 15 tr/min.
   note: La solution bloquante doit contenir du sérum de l’espèce hôte chez laquelle les anticorps secondaires ont été élevés (p. ex., chèvre, âne) et filtrés stérilement à travers un filtre de 0,22 μm avant l’utilisation.
9. Préparez la solution de dilution d’anticorps (97 mL de DPBS, 2,5 g de BSA, 2,5 mL de sérum (provenant de la même espèce hôte à partir de laquelle l’EPL est préparé) et 0,5 mL de Triton X-100). Diluer l’anticorps primaire à l’aide de la solution de dilution d’anticorps et ajouter 500 μL de la solution à chaque échantillon. Scellez la plaque avec du Parafilm et incubez une nuit à 4 °C sur un rocker.
   note: Les anticorps primaires de Nestin et de Sox2 ont été dilués à 1:400 dans une solution de dilution d'anticorps à partir de la concentration initiale du fabricant.
10. Aspirez la solution d’anticorps de chaque échantillon et lavez les échantillons avec du PBST pendant 60 min à température ambiante sur une bascule à 15 tr/min. Répétez l’étape de lavage 3 fois.
11. Diluer les anticorps secondaires et 5 mg/mL de DAPI stock (1:2 000) à l’aide de la solution de dilution d’anticorps et ajouter 500 μL de la solution à chaque échantillon. Couvrez la plaque à 24 puits d’une feuille d’aluminium et incubez toute la nuit à 4 °C sur un rocker.
    note: Comme les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière, les échantillons doivent être protégés du photoblanchiment pour toutes les étapes suivantes. Les anticorps secondaires anti-souris de chèvre et de chèvre anti-lapin ont été dilués à 1:500 dans une solution de dilution d'anticorps à partir de la concentration initiale du fabricant.
12. Aspirez la solution d’anticorps de chaque échantillon et lavez les échantillons avec du PBST pendant 30 minutes à température ambiante sur le rocker. Répétez l’étape de lavage 3 fois.
13. Placez une goutte de support de montage rigide sur la surface d’une diapositive de verre. À l’aide d’une pince, retirez l’excès de solution du moule en épongeant légèrement le bord du moule sur une serviette en papier. Placez délicatement le moule à l’envers sur le support de montage et évitez d’introduire des bulles.
14. Laisser durcir le fluide de montage pendant 48 h à température ambiante. Conservez les échantillons à température ambiante ou à 4 °C. Laissez le milieu de montage prendre complètement pendant 48 h avant l’imagerie, car l’indice de réfraction du milieu changera au cours du durcissement. Scellez les échantillons sur la lame de couverture en verre avec du vernis à ongles transparent pour atténuer la contamination ou le mouvement de l’échantillon.
15. Imagez les échantillons à l’aide d’un microscope confocal.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Encapsulation cellulaire dans des hydrogels ELP 3D
Filtres à seringue de 0,22 μm	Millipore	SLGV004SL
Feuille de silicone de 0,5 mm d’épaisseur	Science de la microscopie électronique	Référence 70338-05
Plaques de culture tissulaire à 24 puits	Corning	353047
Poinçon de biopsie jetable (2 mm)	Integra Miltex	33 à 31
Poinçon de biopsie jetable (4 mm)	Integra Miltex	33 et 34
Poinçon de biopsie jetable (5 mm)	Integra Miltex	33 à 35
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Corning	Référence 21-031-CM
N° 1 lamelles en verre de 12 mm	Thermo Fisher Scientific	Tél. : 12-545-80
Chlorure de tétrakis(hydroxyméthyl)phosphonium (THPC)	Sigma-Aldrich	404861-100ML
0,5 % Tryspin/EDTA	Thermo Fisher	15400054
Immunocytochimie de cellules dans des hydrogels ELP 3D
16 % (p/v) de paraformaldéhyde (PFA)	Sciences de la microscopie électronique	Référence 15701
Albumine sérique bovine (BSA)	Roche	3116956001
DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate)	Sondes moléculaires	D1306
Sérum d’âne	Laboratoires biologiques de Lampire	Référence 7332100
Anticorps secondaire anti-souris de chèvre (AF488)	Sondes moléculaires	A-11017
Anticorps secondaire anti-lapin de chèvre (AF546)	Sondes moléculaires	A-11071
Sérum de chèvre	Gibco	Référence 16210-072
Anticorps primaire Nestin de souris	BD Pharmingen	556309
Anticorps primaire Sox2 de souris	Technologie de signalisation cellulaire	N° 23064S
vernis à ongles	Sciences de la microscopie électronique	Référence 72180
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Support de montage Vectashield Hardset	Laboratoires vectoriels	H-1400