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1. Conjugaison des peptides d’anticorps
REMARQUE : L’acide cholique lié à la NLS (ChAcNLS) peut être synthétisé chez n’importe quel fabricant de peptides commercial ou sur une plate-forme de service de synthèse de peptides affiliée à une université.
- Dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL, préparer une solution de 10 mg/mL (~1 mg d’anticorps totaux) de 7G3 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,6.
- Dissoudre le sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 5 à 10 mM. Le vortex complet de la solution fonctionne le mieux afin d’obtenir une dissolution complète.
- Ajouter dans le tube contenant le 7G3 la solution soufrée-SMCC dissoute (généralement entre 5 et 20 μL selon le rapport molaire de sulfo-SMCC-à-7G3 souhaité). Il est recommandé de tester les rapports sulfo-SMCC-à-7G3 de 10-, 25-, et 50-to-1. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
- Purifier et concentrer le 7G3 dérivé du maléimide à l’aide d’un dispositif d’ultrafiltration et d’un échange de tampon dans du PBS, pH 7,0. Centrifugeuse à 8 000 x g pendant environ 5 min. Jeter le coulée et remplir de PBS, pH 7,0 et centrifuger à nouveau.
- Effectuez cette opération 7 à 8 fois pour remplacer complètement la mémoire tampon. Récupérez la protéine 7G3 concentrée en plaçant le dispositif de filtration à l’envers dans un tube de microcentrifugation propre. Centrifuger pendant 2 min à 1 000 x g. Le volume de récupération doit être d’environ 0,3 ml.
- Dans le tube contenant le 7G3 activé par le maléimide, ajouter un excès molaire de 2 fois de ChAcNLS par rapport au rapport sulfo-SMCC-/7G3 utilisé à l’étape précédente et incuber pendant une nuit à 4 °C. Par exemple, si un rapport sulfo-SMCC-1-7G3 de 10 pour 1 a été utilisé, utilisez un rapport ChAcNLS-7G3 de 20 pour 1. Le volume total ne doit pas être modifié de manière significative.
note: Bien que le ChAcNLS ne provoque pas de précipitations pendant le processus de conjugaison, il s’agit d’une possibilité qui pourrait se produire avec d’autres peptides. Observez le tube pendant la réaction pour détecter des signes de précipitation, qui sont probablement causés lorsque les peptides sont hydrophobes. Dans ces cas, il peut être utile de réexaminer le peptide d’intérêt afin de concevoir des changements pour fournir une hydrophilie accrue.
- Concentrez le 7G3-ChAcNLS à l’aide d’un appareil d’ultrafiltration à la concentration souhaitée et échangez le tampon dans un PBS pH 7,4 (voir étape 1.4). Le rendement de récupération des protéines totales doit être ≥ 75 % de la matière première d’origine.
- Effectuer une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) pour évaluer les candidats 7G3-ChAcNLS construits à l’aide d’un gel de polyacrylamide à 12 % (permet une séparation suffisante des chaînes lourdes et légères conjuguées ChAcNLS des chaînes non conjuguées). Mélangez 10 μg de 7G3-ChAcNLS dans un tampon de chargement PAGE contenant 2 μL de β-mercaptoéthanol et chargez dans le puits.
- Réglez la tension appropriée (120 V pendant 1 h pour un gel à 12 %) et lancez l’électrophorèse. Arrêtez l’électrophorèse lorsque le front du colorant Coomassie atteint le bas du gel.
note: Ne laissez pas l’avant du colorant Coomassie s’écouler du gel.
- Retirer le gel de l’appareil d’électrophorèse et le rincer avec une solution de décoloration contenant 10 % v/v d’acide acétique glacial et 20 % v/v de méthanol.
- Prenez une photo du gel et avec une règle et mesurez la distance (cm) migrée pour les étalons et les conjugués 7G3. Calculez la valeur du facteur de rétention (Rf), qui est la distance migrée divisée par la longueur du gel (à partir de laquelle la protéine est chargée vers le front de migration de Coomassie). Tracez le poids moléculaire (MW) en logarithmique par rapport aux valeurs Rf de chaque étalon protéique et extrapolez la taille des conjugués 7G3.
- Calculez le nombre de peptides par anticorps en divisant la différence de MW entre les conjugués 7G3 et 7G3 non modifiés par 1768,5 g/mol (MW de ChAcNLS).
- Prenez des images numériques du gel coloré à Coomassie et effectuez une analyse densitométrique. À ce stade, la sélection d’un candidat principal peut être basée sur le CA avec le nombre maximal de molécules ChAcNLS qui ne contient pas d’espèces agrégées significatives.
2. Microscopie confocale pour l’évaluation de l’accumulation intracellulaire
REMARQUE : Il est important de tester la sélectivité cellulaire de l’accumulation intracellulaire des mAbs modifiés par des peptides avant de développer des formulations présentant une charge utile d’intérêt. Étant donné qu’il a également été démontré que Tat a une propension à la pénétration cellulaire non spécifique, il vaut la peine d’analyser d’abord l’accumulation intracellulaire et la sélectivité cellulaire avant d’entreprendre des étapes de développement coûteuses avec des charges utiles coûteuses. Pour cette raison, la procédure 1 devrait également modifier les anticorps monotypes de contrôle non pertinents spécifiques aux isotypes. Pour la suite du protocole, nous travaillerons avec des AC modifiés avec 10 molécules ChAcNLS par anticorps. Un schéma comprenant les étapes clés des procédures 2 et 3 est décrit à la figure 1.
ATTENTION : Cette étape du protocole implique la manipulation et la manipulation du paraformaldéhyde. Veuillez suivre les instructions du fabricant lors de la manipulation.
- Traiter les cellules TF-1a cibles avec 200 nM de 7G3-ChAcNLS, y compris des anticorps monoblocs de contrôle modifiés. Incuber 5 x 106 cellules antigéniques positives avec les conjugués pendant 1 h à 37 °C.
- Après 1 h, retirer le surnageant et laver avec 1 mL 3x dans du PBS glacé. Ajouter du milieu frais et incuber pendant une heure supplémentaire à 37 °C.
- Après l’heure supplémentaire, retirer le surnageant et laver 3 fois dans 1 mL de PBS glacé. Ajouter 0,5 mL de PBS contenant 0,25 % de trypsine et d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 37 °C pendant 3 à 30 min.
note: Lors des premiers essais pilotes, il est recommandé de ne pas trypsiniser les cellules afin de déterminer les différences d’accumulation intracellulaire de CA. Ce protocole promeut l’utilisation de la trypsine, et nous démontrons comment cela améliore l’évaluation de l’efficacité de l’accumulation intracellulaire de différents candidats AC.
- Testez les différents moments d’incubation en vérifiant visuellement si toutes les cellules sont détachées. De plus, incuber des aliquotes cellulaires avec des solutions de coloration de viabilité et effectuer une analyse cytométrique en flux comme décrit précédemment.
- Neutraliser la trypsine avec 1,5 mL de milieu de culture cellulaire RPMI 1640/10 % de sérum fœtal bovin. Centrifugez les cellules à 500 x g pendant 5 min, éliminez le surnageant et lavez-les 3 fois dans 0,5 mL de PBS glacé
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- Fixer les cellules dans 0,5 mL de PBS contenant 1 % de paraformaldéhyde et 1 % de saccharose sur de la glace pendant 30 min. Laver les cellules 3x dans 0,5 mL de PBS glacé et centrifuger à 250 x g pendant 5 min. Perméabiliser les cellules dans 0,5 mL de PBS contenant 0,15 % de Triton X-100 pendant 5 min sur glace. Laver les cellules dans du PBS glacé et répéter la centrifugation.
- Mettre en suspension les cellules dans 0,1 mL de PBS contenant 2 μg/mL (ou la concentration recommandée par le fabricant) d’un anticorps polyclonal secondaire Fc anti-murin (isotype spécifique) conjugué à AlexaFluor 647 pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
- Centrifuger à 250 x g pendant 5 min et laver les cellules 3x dans 0,5 mL de PBS glacé. Cellules en suspension dans 0,5 mL de PBS.
pause: Les cellules peuvent être conservées dans le réfrigérateur.
note: Il est essentiel de sélectionner un anticorps secondaire qui reconnaît l’isotype correct de l’AcM d’intérêt. AF647 est choisi en raison de son émission dans l’infrarouge lointain, qui n’interfère pas avec la coloration à l’iodure de propidium (PI) du noyau.
- Ajouter de l’IP à une concentration de 10 μg/mL dans le récipient contenant les cellules. Ensuite, montez 1 x 105 cellules sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage et couvrez avec une lamelle en verre.
- Examinez des cellules avec un objectif à immersion dans l’huile Plan Apo 60X NA 1.42 sur un microscope confocal à balayage laser inversé. Détectez la fluorescence PI à l’aide du laser à argon de 488 nm et du prisme de balayage spectral réglé pour 600 - 650 nm. Pour la fluorescence AF647, utilisez le laser hélium-néon de 633 nm et le prisme de balayage spectral réglé pour 650 - 700 nm. Collectez les émissions de fluorescence de PI et AF647 de manière séquentielle.
note: Utilisez le même paramètre tout au long de l’évaluation et de la comparaison des cellules. Cependant, vous devrez ajuster les paramètres des cellules trypsinisées par rapport aux cellules non trypsinisées.
- Utilisez un logiciel de microscope pour acquérir des images. Collectez des images à l’aide de sections optiques horizontales en série de 1 024 x 1 024 pixels avec une moyenne de ligne 2X prise à des intervalles de 0,5 μm sur toute l’épaisseur de la cellule. Présentez les images sous forme de projections z empilées à partir de quatre coupes consécutives à l’intensité de fluorescence maximale.
- Analysez des cellules à l’aide d’un logiciel de microscope. Enregistrez le modèle de distribution cellulaire des conjugués. Plus précisément, évaluer si la fluorescence intracellulaire dans le cytoplasme est groupée et proche de la surface cellulaire ou diffuse et homogène. Évaluez également l’intensité relative de la fluorescence par cellule.
