Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation du cathéter avant la chirurgie stéréotaxique
- Coupez les cathéters PE50 (6 cm de longueur) qui seront utilisés pour connecter la canule aux pompes osmotiques (voir Figure 1). Remplissez les cathéters PE50 avec du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) et scellez les deux extrémités des cathéters. Maintenez le cathéter à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
2. Implantation de canules par stéréotaxie
- Effectuez la chirurgie dans des conditions stériles. Stérilisez tous les instruments et matériaux chirurgicaux par autoclavage. Nettoyez soigneusement l’appareil stéréotaxique et la zone de travail et désinfectez-le avec une solution d’éthanol à 70 %. Portez un masque chirurgical, un bonnet pour les cheveux et des gants stériles.
- Anesthésier les rats en injectant par voie intrapéritonéale (i.p.) une solution de kétamine et de xylazine (100 mg/kg et 10 mg/kg, respectivement). Confirmez l’anesthésie en vérifiant le mouvement après un léger pincement des orteils.
- Injecter un anti-inflammatoire non stéroïdien (méloxicam ; 1 mg/kg) par voie sous-cutanée (s.c.) à l’animal anesthésié au moins 30 minutes avant la chirurgie.
- Rasez la tête de l’animal à l’aide d’une tondeuse et désinfectez la peau trois fois avec une solution de gluconate de chlorhexidine à 2 % et d’alcool isopropylique à 2 %. Appliquez une pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Placez l’animal sur un cadre stéréotaxique avec les barres d’oreille. Fixez une canule sur le bras porteur du cadre stéréotaxique. Injecter (s.c.) un agent anesthésique local (bupivacaïne (1,5 mg/kg) et lidocaïne (1,5 mg/kg) sur le dessus de la tête. L’anesthésie est maintenue pendant toute la procédure par la mise en place d’un cône nasal délivrant 3 % d’isoflurane. L’ensemble du champ opératoire devrait être drapé, mais cela n’a pas été fait ici pour mieux démontrer la technique.
- Faites une incision de 3 cm sur le dessus de la tête à l’aide d’un scalpel. Installez 4 pinces autour de l’incision pour laisser le crâne dégagé. À l’aide d’un ciseau à bout rond, faites une poche (2 x 2 cm2) sous la peau entre les omoplates de l’animal.
- Grattez le périoste du crâne avec une lame. Appliquez un tampon de gaze sur le crâne s’il saigne.
- Vérifiez que le crâne est plat et bien aligné sur le cadre stéréotaxique. Pour vous assurer que le crâne est plat, vérifiez les coordonnées de hauteur au niveau du bregma et du lambda. Prenez les coordonnées bregma qui seront utilisées comme point de référence.
- En partant du bregma, calculez les coordonnées des deux canules guides qui seront implantées bilatéralement dans l’hippocampe (antéropostérieure : - 0,42 cm ; médiolatérale : ± 0,30 cm ; dorso-ventrale : - 0,28 cm selon l’atlas du cerveau de rat Paxinos et Watson). Indiquez la position de la canule à l’aide d’un marqueur.
- Percez un trou (0,5 mm) dans le crâne au point d’implantation des deux canules. Percez deux autres trous à environ 5 mm au-dessus et en dessous de ces points pour insérer des vis qui solidifieront la canule lors de l’application de ciment dentaire.
- Coupez une extrémité du cathéter préalablement rempli d’aCSF à l’aide d’un scalpel et insérez-le dans le bras incliné de la canule. Fixez la première canule avec du ciment dentaire. Évitez de mettre du ciment dentaire autour de la position sur la deuxième canule.
- Laissez sécher le ciment dentaire pendant 2 à 3 minutes, puis retirez le bras du support de la première canule et fixez-y la deuxième canule. Répétez les étapes 2.11 et 2.12. Placez une canule factice sur les deux canules de guidage. Assurez-vous que la tétine et la canule guide sont de la même longueur pour éviter l’infiltration de tissu et le blocage de la canule.
- Insérez l’extrémité libre des deux cathéters dans la poche préalablement pratiquée entre les omoplates de l’animal. Retirez les pinces et cousez la peau avec un fil de suture 4-0.
note: La canule guide supérieure doit être accessible pour les prochaines perfusions d’Aβo.
- Retirez l’animal du cadre stéréotaxique et remettez-le dans sa cage. Pendant la récupération post-chirurgicale, placez la cage sur une couverture d’eau chauffante jusqu’à ce que l’animal se réveille. La cage doit être partiellement sur le coussin afin que le rat puisse échapper à la chaleur si nécessaire. Surveillez constamment l’animal jusqu’à ce qu’il retrouve une conscience suffisante pour maintenir sa décubitus sternal.
- Retournez les rats à l’animalerie pour qu’ils se remettent de l’opération pendant 10 jours sous étroite surveillance.
note: Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli. Le méloxicam (1 mg/kg) est administré une fois par jour pendant deux jours après la chirurgie pour traiter la douleur.
3. Installation de la pompe osmotique
- Un jour avant l'installation, remplissez les pompes osmotiques avec l'anticorps 6E10 (1 mg/ml ; 100 μl) et contrôlez l'anticorps IgG1 (1 mg/ml ; 100 μl) conformément aux instructions du fabricant dans des conditions stériles. Conservez les pompes dans de l’eau distillée stérile à 37 °C pendant la nuit pour activer les pompes.
- Anesthésier des rats avec de l’isoflurane à 3 % pour installer des pompes osmotiques (0,5 μl/h pendant 7 jours). Rasez-vous entre les omoplates et désinfectez la peau avec une solution de gluconate de chlorhexidine 2 % et d’alcool isopropylique 2 %. Faites une incision de 2 cm avec un scalpel entre les omoplates pour localiser les cathéters PE50 reliés à la canule de guidage.
- Coupez l’extrémité des cathéters PE50 contenant du ciment dentaire à l’aide d’un scalpel. Connectez les pompes osmotiques aux cathéters PE50 et ajoutez un peu de ciment dentaire à la jonction de la pompe et du cathéter pour sécuriser la connexion.
- Cousez la peau fermement avec un fil de suture 4-0. Remettez l’animal dans sa cage sur un coussin d’eau chauffant. Observer l’animal se réveiller rapidement d’une anesthésie à l’isoflurane (environ 5 min).
note: L’intervention dure environ 5 à 10 min.
4. Perfusions Aβo chez des rats éveillés et se déplaçant librement
- Préparez la solution d’Aβo (0,2 μg/μl). Laisser Aβo s’agréger dynamiquement et spontanément pendant 1 heure à température ambiante avant l’infusion.
- Installez deux seringues de 10 μl sur une pompe à perfusion. Remplissez les seringues avec 5 μl d’eau distillée stérile. Coupez deux cathéters PE50 d’environ 60 cm de long à l’aide d’un scalpel. Remplissez les deux cathéters avec de l’eau distillée stérile à l’aide de seringues de 1 ml et d’aiguilles de 21 G.
- Gardez les seringues de 1 ml à une extrémité du cathéter et connectez l’autre extrémité aux seringues Hamilton. Retirez les seringues de 1 ml et vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur des cathéters.
- Insérez la canule interne à l’extrémité des cathéters PE50. À l’aide d’eau distillée stérile, remplissez la canule interne reliée aux cathéters PE50 jusqu’à 1 μl sur les seringues Hamilton. Faites une bulle d’air en tirant les pistons vers l’arrière jusqu’à 2 μl.
- Mélangez la solution Aβo en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pointe d’adhérence minimale. Évitez de former des bulles pendant le mélange. Remplissez les deux canules internes avec 1,5 μl de solution Aβo en tirant les pistons vers l’arrière jusqu’à 3,5 μl.
- Faites des lignes avec un marqueur avant et après la bulle d’air dans les deux cathéters. Cela sert de point de contrôle pour la perfusion en cours. Pour la perfusion, approchez la cage de la pompe à perfusion et retirez son couvercle.
- Placez le rat dans un câlin et grattez fermement le bras du câlin autour de son cou pour immobiliser la tête du rat. Retirez la canule factice des deux canules de guidage. Insérez la canule interne préalablement préparée dans la canule de guidage. Vérifiez qu’ils sont bien insérés et bien fixés à la base de la canule de guidage.
- Libérez le rat de son câlin et remettez-le dans sa cage pour limiter le stress de contention. Surveillez de près pour vous assurer que les cathéters ne se tordent pas ensemble et que la perfusion est effectuée correctement.
- Allumez la pompe à perfusion. Injecter 1 μl de solution d’Aβo à un débit de 0,1 μl/min (10 min). Pendant la perfusion, vérifiez que le piston de la seringue se déplace de 3,5 μl à 2,5 μl et que la bulle d’air dans les deux cathéters PE50 se déplace en continu.
- Laissez la canule interne en place pendant encore 5 minutes après la perfusion pour permettre une diffusion efficace de la solution Aβo. Ramenez le rat dans le câlin pour retirer la canule interne et la canule de guidage bouchée pour éviter le reflux de la solution injectée. Utilisez une canule factice qui s’arrête juste avant le bras d’angle de la canule. Remettez l’animal dans sa cage.
- Répétez l’infusion d’Aβo une fois par jour pendant 6 jours consécutifs. Euthanasier l’animal par décapitation.
