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1. Fabrication et fonctionnalisation de l’immunosonde capacitive
- Coupez une longueur de 25 cm de fil de platine enduit de perfluoroalcoxy (PFA) (voir le tableau des matériaux) et dénudez environ 5 mm de revêtement PFA à une extrémité à l’aide d’un scalpel, en prenant soin de ne pas couper le fil de platine.
- Insérez l’extrémité dénudée du fil de platine dans une goupille de connecteur mâle de 1 mm plaquée or et sertissez les dents de la goupille du connecteur autour de l’extrémité dénudée du fil de platine à l’aide d’une pince à bec effilé (voir le tableau des matériaux).
- Soudez le fil de platine à la broche du connecteur plaqué or. Attention à ne pas utiliser une quantité excessive de soudure.
- Préparez une solution de dopamine en dissolvant 50 mg de HCl de dopamine dans 50 ml de solution saline tamponnée au phosphate de 10 mM (PBS, pH 6,0) en agitant.
- Une fois que la dopamine est complètement dissoute, placez l’extrémité du fil de platine dans le récipient contenant le PBS fraîchement préparé et supplémenté en dopamine. Branchez une broche de connecteur dorée dans un canal de la tête (voir le tableau des matériaux).
- Connectez l’électrode à disque en chlorure d’argent (AgCl) (électrode de terre, voir tableau des matériaux) au canal de masse dans la tête. Placez le disque AgCl dans le récipient contenant du PBS et du fil de platine supplémentés en dopamine ; Veillez à ne submerger que l’électrode du disque et non la longueur du fil ou de la soudure. Connectez un shunt de fil dans les canaux de référence de l’étage avant de continuer.
- Ouvrez le logiciel interactif d’acquisition de données (voir la Table des matériaux). Préparez un protocole de potentiel de commande d’électrodéposition en dents de scie avec les paramètres suivants : potentiel de démarrage = −0,6 V ; potentiel final = +0,65 V ; taux de balayage = 0,04 V∙s-1 ; durée du dépôt = 420 s. Commencez le protocole de dépôt de polydopamine, en vous assurant que tous les fils sont correctement connectés.
- Après avoir terminé le dépôt de polydopamine, retirez la pastille broyée AgCl et la pointe du fil de platine du récipient, en prenant soin de ne pas déranger la pointe de l’électrode du fil de platine. Placez l’extrémité du fil dans un microtube contenant du PBS (pH 7,4) pendant 2 à 5 minutes pendant que la solution d’anticorps est préparée ; Assurez-vous que l’embout du fil n’entre pas en contact avec les côtés ou le fond du microtube.
REMARQUE : Une solution d’anticorps peut être fabriquée lors du dépôt de polydopamine ; cependant, le transfert du fil de platine du récipient contenant de la dopamine au microtube de PBS après le dépôt de polydopamine ne doit pas être ignoré.
- Préparez la solution d’anticorps. Combinez l’anticorps d’intérêt avec le PBS (pH 7,4) dans un rapport de 1:20 dans un récipient de taille appropriée (par exemple, un microtube).
REMARQUE : L’anticorps monoclonal anti-neuropeptide Y (anti-NPY) (voir le tableau des matières) utilisé ici a été aliquote à 1 mg/mL ; un exemple de préparation d’anticorps ici serait de 4 μL d’anticorps pour 76 μL de PBS.
- Faites tremper l’extrémité de l’électrode de platine déposée dans de la polydopamine dans une solution d’anticorps pendant au moins 2 h à température ambiante, en vous assurant à nouveau que l’extrémité du fil de platine est suspendue dans la solution et ne repose pas sur la surface intérieure du microtube.
REMARQUE : La mise en œuvre récente de cette technique a favorisé l’utilisation de l’électrode en fil de platine immédiatement après cette étape au lieu d’un stockage humide ou sec pour une utilisation ultérieure.
- Après avoir trempé dans la solution d’anticorps, rincez brièvement l’extrémité de l’immunosonde capacitive (sonde CI) nouvellement fonctionnalisée dans du PBS (pH 7,4). La sonde est maintenant prête à l’emploi.
2. Dispositif expérimental pour la détection et la mesure in vitro de peptides
- Placez l’extrémité fonctionnelle de la sonde CI dans la chambre d’écoulement, en prenant soin de ne pas déranger l’extrémité de l’électrode de quelque manière que ce soit, car cela pourrait endommager l’extrémité sensorielle de la sonde.
REMARQUE : La chambre d’écoulement a été créée en versant de l’élastomère de silicone (voir tableau des matériaux) dans une boîte de culture de 35 mm avec un remplissage d’espace ovoïde allongé au centre de la boîte. Après durcissement, la forme ovoïde est retirée de l’élastomère. La chambre est ensuite superfusionnée avec une solution saline tamponnée au Tris (TBS) et permet un débit de 3 mL/min. S’assurer que l’entrée et la sortie maintiennent le niveau de fluide dans la chambre de manière à ce qu’aucune action de marée du superfusat ne soit observée. Le flux doit rester en place aussi longtemps que la sonde CI est utilisée.
- Avant le premier test expérimental, effectuez une exécution standard TBS pour conditionner la sonde CI. Configurez le protocole de tension de commande suivant : potentiel de pas positif = +100 mV ; potentiel de pas négatif = −5 mV ; durée du pas = 20 ms ; Durée d’acquisition = 600 s.
REMARQUE : Il est important de tenir compte de l’équilibrage de la sonde pendant la phase initiale du potentiel de commande de cyclage avant l’acquisition des données.
- Créez une solution du peptide d'intérêt en utilisant le même TBS pour maintenir la composition du superfusat. Mettez en place un système de collecteur où le superfusat peut être commuté entre le TBS et le TBS supplémenté en peptides sans introduire de bulles dans le système de tuyauterie ou la chambre d’écoulement.
REMARQUE : Le peptide NPY porcin synthétique (voir le tableau des matières) a été utilisé dans la présente étude.
- Configurez le protocole d’acquisition de données de détection de peptides à l’aide des paramètres standard TBS (voir étape 2.2.).
REMARQUE : Dans cette mise en œuvre, la durée de chaque essai expérimental était de 360 s (TBS 120 s, TBS 120 s supplémenté en peptides, TBS 120 s).