1. Préparation avant l’étiquetage
- Préparation et entretien des cultures primaires d’hippocampe
- Préparez des cultures primaires d’hippocampe à une densité de 150 000 cellules dans des verres de protection de 18 mm enrobés de poly-D-lysine (0,1 mg/mL). D’excellents guides pour la préparation de cultures neuronales dissociées sont disponibles.
note: Si nécessaire, les cultures peuvent être traitées avec de la cytosine arabinoside (Ara-C, 10 μM à partir de jours in vitro 1 [DIV1]) pour éviter la prolifération gliale dans la préparation.
note: D’autres réactifs d’enrobage tels que la fibronectine (1 mg/mL) ou la laminine (5 μg/mL) peuvent être utilisés à la place de la poly-D-lysine.
- Maintenir les cultures dans un incubateur cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2 dans 2 mL/puits de milieux neurobasaux complétés par de la B27 et 2 mM de L-glutamine.
note: Des substituts de la L-glutamine (par exemple, Glutamax) peuvent être utilisés, si vous le souhaitez.
- Sur une base hebdomadaire, prélever la moitié du volume de milieu et le remplacer par le même volume de milieu neurobasal supplémenté.
- FACULTATIF : Transfection de récepteurs mutés et/ou marqués par des épitopes
REMARQUE : Les neurones doivent être transfectés au moins 3 à 4 jours avant le point d’analyse pour permettre l’expression du récepteur. L’utilisation de neurones jeunes (DIV6-9) permet d’obtenir une meilleure efficacité de transfection que les neurones plus âgés (DIV15-20), mais un nombre suffisant de cellules transfectées (>20) peut être atteint quel que soit le DIV utilisé.
- Pour chaque puits d’une plaque à 12 puits, diluer 1,5 μg de plasmide contenant la construction d’intérêt dans 100 μL de milieu neurobasal frais sans supplémentation en B27 ou en glutamine dans un tube de microcentrifugation et mélanger rapidement par vortex.
note: Pour une transfection réussie, il est essentiel que le milieu neurobasal utilisé soit aussi frais que possible, idéalement moins d'1 semaine après l’ouverture du flacon.
- Dans un deuxième tube de microcentrifugation, mélanger 1 μL d’un réactif de lipofection approprié dans 100 μL de milieu neurobasal frais et mélanger délicatement.
note: Ne pas vortex le mélange de réactifs de lipofection. L’utilisation de réactifs de lipofection frais peut améliorer l’efficacité de la transfection.
- Incuber les tubes pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Ajouter le mélange de réactifs de lipofection goutte à goutte au mélange d’ADN, mélanger doucement et incuber pendant 20 min à RT.
- Ajustez le volume du support dans chaque puits à 1 mL de support conditionné.
- Ajouter le mélange réactif de lipofection-ADN goutte à goutte dans le puits.
- Renvoyez les cellules dans l’incubateur et laissez au moins 3 à 4 jours pour l’expression des protéines.
note: Pour les besoins des protocoles d’internalisation et de recyclage décrits ci-dessous, les neurones de l’hippocampe ont été transfectés aux DIV11-12 avec des constructions exprimant GluN2B marquées avec une protéine fluorescente verte (GFP) dans le domaine extracellulaire (GFP-GluN2B) et imagées aux DIV15-16.
- FACULTATIF : Incubation des cellules avec des médicaments (de manière chronique ou aiguë) dans les milieux conditionnés jusqu’à fixation.
REMARQUE : Pour un traitement aigu, commencez à traiter les cellules avant l’étiquetage. Selon le protocole de traitement médicamenteux utilisé, les cellules peuvent être maintenues dans des milieux contenant du médicament pendant la section 2. Dans notre exemple, les cellules DIV21 ont été soumises à un protocole de potentialisation à long terme induite chimiquement (cLTP) pour augmenter le récepteur de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPAR) exprimé en surface.
- Milieu conditionné par échange pour solution extracellulaire (ECS).
- Traiter les cellules avec 300 μM de glycine dans le SEC pendant 3 min à RT. Comme témoin, traiter une lamelle sœur avec ECS (sans glycine).
- Laver les cellules 3 fois avec un ECS à 37 °C et remettre les cellules dans le SEC (sans glycine) dans l’incubateur cellulaire pendant 20 min avant de poursuivre avec la section 2.
REMARQUE : ECS (en mM) : 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinethanesulfonique (HEPES), 30 glucose, 0,001 tétrodotoxine (TTX), 0,01 strychnine et 0,03 picrotoxine à pH 7,4.
2. Marquage en direct des récepteurs exprimés en surface
- Préparer les lamelles pour l’étiquetage
- Pour économiser les réactifs et faciliter la manipulation, transférez les lamelles côté cellule vers le haut dans un plateau recouvert d’un film de paraffine.
REMARQUE : Il est essentiel de ne jamais laisser les échantillons sécher.
- Conservez et maintenez les milieux conditionnés à 37 °C pour les étapes d’incubation et de lavage.
note: Pour une lamelle de 18 mm, une incubation avec 75 à 100 μL de milieu pour l’étiquetage des anticorps et 120 à 150 μL pour l’internalisation/le recyclage est recommandée.
- Marquage des récepteurs de surface avec des anticorps primaires
- Incuber des cellules avec des anticorps primaires dilués dans un milieu conditionné pendant 15 min à RT.
note: Pour les récepteurs marqués à la GFP, on a utilisé un anticorps anti-GFP de lapin à une dilution de 1:1000. Pour le GluA1 endogène, on a utilisé un anti-GluA1 de souris à une dilution de 1:200.
- Aspirez soigneusement le milieu contenant des anticorps à l’aide d’une pipette à vide et lavez les cellules trois fois avec un milieu conditionné.
note: En l’absence de milieu conditionné, toutes les étapes de lavage peuvent être effectuées à l’aide de PBS+ [solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 mM de MgCl2 et 0,1 mM de CaCl2]. Une aspiration manuelle à l’aide d’une micropipette peut être effectuée si une aspiration intra-utérine douce n’est pas disponible.
3. Expression de surface (Figure 1)
- Marquage secondaire par anticorps des récepteurs exprimés en surface
- Lavez une fois avec PBS+.
- Fixer les cellules en les incubant avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) et 4 % de saccharose dans du PBS pendant 7 à 8 min
note: Contrairement à d’autres méthodes de fixation telles que l’incubation au méthanol, le PFA ne perméabilise pas la membrane plasmique et convient donc à l’analyse de l’expression de surface. Pour des résultats optimaux, utilisez du PFA fraîchement préparé. Le stockage à court terme du PFA à 4 °C ou le stockage à long terme (jusqu’à 30 jours) à -20 °C sont permissifs pour une fixation adéquate.
prudence: Le PFA est un cancérogène connu. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et une cagoule de sécurité lors de la manipulation.
- Laver les cellules trois fois avec du PBS.
régulier
note: Alternativement, la glycine 0,1 M peut être utilisée pour laver le PFA au lieu du PBS, car la glycine éteindra tout fixateur restant qui pourrait augmenter le bruit de fond dans la préparation.
- Bloquez les sites de liaison non spécifiques en incubant avec 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS pendant 30 min à RT.
note: Le temps de blocage peut être prolongé sans effets néfastes sur l’étiquetage.
- Incuber avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence et dilué dans 3 % NGS dans du PBS pendant 1 h à RT pour marquer les récepteurs primaires marqués par anticorps (c.-à-d. exprimés en surface).
note: Dans ces exemples, une dilution de 1:500 d’anticorps secondaires conjugués à Alexa 555 : anti-lapin de chèvre pour les récepteurs marqués à la GFP et anti-souris de chèvre pour GluA1 a été utilisée.
- Laver les cellules avec du PBS 3x.
- Marquage des récepteurs intracellulaires
- Perméabiliser les cellules avec 0,25 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 à 10 min à RT.
note: Pour vérifier que le premier cycle de marquage des anticorps occupe tous les épitopes de surface, cette étape de perméabilisation peut être sautée dans une culture sœur. Dans ce cas, aucun signal pour les récepteurs intracellulaires ne doit être obtenu. De plus, pour vérifier qu’aucun récepteur interne n’a été marqué dans la section 2 précédente (c’est-à-dire montrant l’intégrité des membranes plasmiques en culture), l’étape de perméabilisation peut être sautée dans une culture sœur, et un anticorps primaire contre une protéine intracellulaire (par exemple, la protéine de densité postsynaptique 95 [PSD-95] ou la protéine associée aux microtubules 2 [MAP2]) peut être utilisé à l’étape 2.2.1. Aucun signal ne doit être obtenu de ce primaire dans ces conditions. Dans ce cas, un anticorps anti-PSD-95 de lapin (1:500) a été utilisé.
- Bloc avec 10 % NGS en PBS pendant 30 min à RT.
- Marquer les récepteurs intracellulaires en incubant des cellules perméabilisées avec le même anticorps primaire utilisé dans la section 2.2 dilué dans 3 % NGS dans PBS pendant 1 h à RT.
note: La dilution de l’anticorps pour le marquage des récepteurs intracellulaires peut être différente de celle requise pour le marquage des récepteurs exprimés en surface. Dans l’exemple de GluA1, la même dilution d’anticorps (1:200) a été utilisée.
- Laver les cellules 3 fois avec du PBS.
- Marquage avec un deuxième anticorps secondaire marqué par fluorescence dilué à 3 % NGS dans du PBS pendant 1 h à RT.
note: Dans ces exemples, une dilution de 1:500 de l’anticorps secondaire conjugué à Alexa 647 de chèvre (pour GluA1) a été utilisée.
- Laver les cellules 3 fois avec du PBS.
4. Internalisation (Figure 2)
- Internalisation des récepteurs de surface marqués par des anticorps
- Après le marquage des récepteurs exprimés en surface et le lavage des anticorps (section 2.2), maintenir les cellules dans des milieux conditionnés sans anticorps et les renvoyer dans l’incubateur (37 °C) pour permettre l’internalisation.
REMARQUE : Pour les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA), il est recommandé de consacrer 30 minutes à l’internalisation. À titre de contrôle, une culture sœur peut être maintenue avec un milieu conditionné à 4 °C pendant le processus d’internalisation. Une internalisation minimale des récepteurs devrait se produire dans ces conditions.
- Marquage des récepteurs de surface
- Lavez les cellules une fois avec PBS+.
- Cellules fixes avec 4 % de PFA et 4 % de saccharose dans du PBS pendant 7 à 8 min
prudence: Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et une cagoule de sécurité lors de la manipulation du PFA.
- Lavez les cellules 3 fois avec du PBS ordinaire.
- Blocage avec 10 % NGS en PBS pendant 30 min à RT pour éviter les liaisons non spécifiques.
- Incuber des échantillons avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence et dilués dans 3 % NGS dans du PBS pendant 1 h à RT pour marquer les récepteurs primaires marqués par anticorps (c’est-à-dire les récepteurs exprimés en surface qui n’ont pas été internalisés).
note: Pour cet exemple, l’anticorps secondaire anti-lapin conjugué à Alexa 555 (1:500) a été utilisé pour l’étiquetage.
- Laver les cellules 3 fois avec du PBS.
- Marquage des récepteurs internalisés
- Perméabiliser les cellules avec 0,25 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 à 10 min.
- Bloquer la liaison non spécifique par incubation avec 10 % de NGS dans le PBS pendant 30 min à RT.
- Incuber des échantillons avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence et dilués dans 3 % NGS dans du PBS pendant 1 h à RT pour marquer les récepteurs marqués par anticorps internalisés.
note: Pour cet exemple, l’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre conjugué à Alexa 647 (1:500) est utilisé pour l’étiquetage.
- Laver les cellules 3 fois avec du PBS.
5. Recyclage (Figure 3)
- Internalisation des récepteurs de surface marqués par des anticorps
- Après le marquage des récepteurs exprimés en surface et le lavage des anticorps (section 2.2), maintenir les cellules dans des milieux conditionnés sans anticorps et les renvoyer dans l’incubateur (37 °C) pour permettre l’internalisation.
REMARQUE : Pour les récepteurs NMDA, il est recommandé de consacrer 30 minutes à l’internalisation.
- Blocage des récepteurs stables exprimés en surface
- Pour bloquer les épitopes de l’anticorps primaire attaché aux récepteurs exprimés en surface qui n’ont pas été internalisés, incuber des cellules avec des fragments d’anticorps Fab anti-IgG (H+L) non conjugués (contre le primaire utilisé dans la section 2.2) dilués dans un milieu conditionné (20 μg/mL) pendant 20 min à RT. Ce traitement empêche toute interaction future avec des anticorps secondaires.
note: Pour cet exemple, des fragments de Fab anti-lapin Chèvre ont été utilisés.
note: Expérience de contrôle : pour s’assurer que le blocage complet des récepteurs exprimés en surface s’est produit, les lamelles sœurs peuvent être incubées avec et sans Fab. Les cultures doivent être fixées immédiatement après le traitement Fab, et les deux cultures sont incubées avec un anticorps secondaire conjugué à Alexa 555. Aucun signal Alexa 555 dans les cellules incubées par Fab n’indique un blocage correct des anticorps.
- Laver les cellules 3x avec des fluides conditionnés.
- Incuber les cellules avec un milieu conditionné contenant 80 μM de dynasore pour empêcher une internalisation ultérieure et renvoyer les cellules dans l’incubateur (37 °C) pour permettre le recyclage des récepteurs internalisés. Dynasore est un inhibiteur de la GTPase qui inhibe la dynamine et empêche donc l’internalisation.
REMARQUE : 45 minutes pour le recyclage NMDAR sont recommandées. Notez que Dynasore bloque exclusivement le processus d’internalisation dépendant de la dynamine (par exemple, l’internalisation des NMDAR). Cependant, l’internalisation d’autres protéines synaptiques (indépendantes de la dynamine) peut toujours se produire en présence de Dynasore.
- Étiquetage des récepteurs recyclés
- Lavez les cellules une fois avec PBS+.
- Cellules fixes avec 4 % de PFA et 4 % de saccharose dans du PBS pendant 7 à 8 min
prudence: Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et une cagoule de sécurité lors de la manipulation du PFA.
- Laver les cellules 3 fois avec du PBS.
- Blocage avec 10 % NGS en PBS pendant 30 min à RT pour éviter les liaisons non spécifiques.
- Marquer les cellules avec le premier anticorps secondaire marqué par fluorescence dilué à 3 % de NGS dans le PBS pendant 1 h à RT.
note: Pour cet exemple, l’anticorps anti-lapin de chèvre conjugué à Alexa 555 (1:500) a été utilisé pour l’étiquetage.
- Laver les cellules 3x avec PBS.
note: Des lavages plus longs avec du PBS (5 à 10 min) peuvent aider à réduire l’arrière-plan dans la préparation.
- Marquage des récepteurs internalisés
- Perméabiliser les cellules avec 0,25 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 à 10 min.
- Bloc avec 10 % NGS en PBS pendant 30 min à RT.
- Marquage avec un deuxième anticorps secondaire marqué par fluorescence dilué à 3 % NGS dans du PBS pendant 1 h à RT.
note: Pour cet exemple, l’anticorps anti-lapin de chèvre conjugué à Alexa 647 (1:500) a été utilisé pour l’étiquetage.
- Laver les cellules 3 fois avec du PBS.
6. Montage et imagerie des échantillons
- Montez les cellules en plaçant délicatement les lamelles, côté cellule vers le bas, sur 12 à 15 μL du support de montage approprié.
note: L’aspiration de supports de montage excédentaires améliorera la qualité des images.
- Cellules d’image sur un microscope confocal approprié.
note: Il est recommandé d’imager une pile z à un grossissement de 60x avec des pas de 0,35 μm, englobant toute l’épaisseur du neurone.
7. Considérations temporelles
- Il s’agit d’un protocole long qui peut être arrêté en plusieurs points. Si vous le souhaitez, effectuez les étapes de blocage et d’incubation des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humide.
- Sinon, si vous le souhaitez, utilisez un processeur de tissus à micro-ondes pour accélérer considérablement les temps d’incubation après la fixation. Pour toutes les étapes, utilisez 150 W à 30 °C pour les paramètres « On ».
- Pour bloquer, exécutez le processeur à 2 min « Allumé », 1 min « Éteint » et 2 min « Allumé ».
- Pour les étapes d’incubation d’anticorps primaires et secondaires, exécutez le processeur à 3 min « On », 2 min « Off » et 3 min « On »
REMARQUE : Nous n’observons aucune différence de qualité en apportant les modifications ci-dessus au protocole.
8. Analyse d’images
- Il est recommandé d’utiliser FIJI pour effectuer l’analyse des images, car il est compatible avec plusieurs formats de fichiers. Pour nos données, des images au format de fichier Nikon ND2 ont été acquises.
- Un script macro est fourni pour faciliter la quantification par lots de différents paramètres présélectionnés par FIJI. Les étapes suivantes sont incluses dans la macro :
REMARQUE : Pour ces exemples, l'« intensité intégrée » a été mesurée.
- Ouvrez les fichiers image dans FIJI et les canaux séparés.
- Projetez Z chaque pile de canaux comme projection d’intensité maximale.
- Définissez un seuil inférieur pour chaque canal.
REMARQUE : Les seuils doivent être déterminés empiriquement pour chaque ensemble de données expérimentales. Bien que chaque canal puisse avoir une valeur de seuil inférieure distincte, il est crucial que les valeurs de seuil de canal soient systématiquement conservées pour toutes les images du même ensemble de données.
- Sélectionnez trois à cinq dendrites secondaires ou tertiaires et enregistrez-les en tant que régions d’intérêt (ROI).
- Mesurez la densité intégrée de chaque retour sur investissement dans les canaux de surface et intracellulaires.
- Normalisez le signal pour chaque retour sur investissement en divisant la valeur de densité intégrée du canal de surface par le canal intracellulaire.
- Répéter les mesures pour toutes les images de contrôle et expérimentales et normaliser les valeurs expérimentales aux valeurs de contrôle (p. ex., GluN2B WT ou conditions sans glycine).
