Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation des microsphères cibles
- Sélectionnez un antigène cible.
pertinent
note: Dans cet exemple, la protéine recombinante V1V2-2F5K a été utilisée, qui a été conçue pour imiter l’apex trimérique de l’enveloppe native du VIH.
- Effectuer la biotinylation à l'aide d'un kit commercial (Table des Matériaux) selon le protocole du fabricant.
- Calculez mmol du réactif de biotine à ajouter à la réaction pour un excès molaire de 5 fois à l’aide de la formule : mmol biotine = mL protéine x (mg protéine/mL protéine) x (mmol biotine/mg protéine) x (5 mmol biotine/mmol protéine). Calculez ensuite μL du réactif de biotine à ajouter à l’aide de la formule : μL biotine = mmol biotine x (1 000 000 μL/L) x (L/10 mmol).
- Équilibrez la biotine à température ambiante avant l’ouverture. Dissoudre les protéines dans 0,5 à 2,0 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) selon le calcul effectué ci-dessus.
- Préparez une solution de 10 mM de réactif de biotine dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et ajoutez le volume approprié de réactif de biotine de 10 mM à la solution protéique, puis incubez la réaction sur de la glace pendant 2 h ou à température ambiante pendant 30 min.
- Éliminer l’excès de biotine à l’aide de concentrateurs de protéines (membranes en polyéthersulfone [PES], poids moléculaire de coupure de 3 kDa, 0,5 mL ; Table des matériaux) selon les instructions du fabricant.
- Déposez l’échantillon dans la chambre supérieure de la colonne de centrifugation et ajoutez du PBS jusqu’à 400 μL. Capuchon, puis insérez cette chambre d’échantillon dans un tube de collecte. Centrifuger à 12 000 x g à température ambiante pendant 30 min.
- Jeter le liquide en continu et ajouter du PBS à 400 μL. Répéter la centrifugation. Jeter l’écoulement continu et ajouter du PBS à 100 μL. Mesurer la concentration en protéines à l’aide d’un spectrophotomètre.
note: Les protéines peuvent être aliquotes et congelées à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
2. Préparation de la plaque de dosage de la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP)
- Protéine biotinylée conjuguée en microsphères de 1 μm (« billes » ; Table des matériaux) selon les instructions du fabricant.
- Par boîte de billes conjuguées, incuber 6 μg de protéines avec 12 μL de billes mères dans 200 μL d’albumine sérique bovine (BSA)-PBS à 0,1 % à température ambiante pendant 1 h, en tourbillonnant doucement toutes les 20 min.
- Centrifuger à 13 000 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, agiter doucement et remettre en suspension dans 1200 μL de BSA-PBS à 0,1 %. Répétez l’étape d’essorage et de lavage 2x. Mettre en suspension dans 1200 μL de BSA-PBS à 0,1 %.
- Aliquote 10 μL de solution de billes par puits dans une plaque à fond rond de 96 puits. Préparez des dilutions d’anticorps ou de sérums immunitaires d’intérêt dans 12 μL de HSA HBSS à 2 %, généralement à partir de 50 μg/mL d’anticorps ou une dilution sérique de 1/100.
note: Dans les données de l’échantillon, l’anticorps monoclonal (mAb) 830A a été utilisé.
- Ajouter 10 μL d’anticorps titrés dans la plaque de billes et incuber pendant 2 h à 37 °C. Ajouter 200 μL de HSA HBSS à 2 % dans chaque puits et plaque de centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min.
- Retirez soigneusement le surnageant en retournant et en transvasant rapidement le liquide des puits de la plaque dans un évier pour éviter de déranger la pastille de bille invisible.
3. Isolement des cellules du lait maternel
- Obtenez du lait maternel humain de femmes allaitantes en bonne santé, exprimé à l’aide de doubles tire-lait électroniques ou manuels. Isolez les cellules dans les ~4 heures suivant l’expression, en maintenant le lait à température ambiante.
- À l’aide de tubes de 50 ml, centrifugez 50 ml de lait à 800 x g pendant 15 min. Versez délicatement le lait écrémé et la graisse tout en laissant la pastille de cellule intacte. Essuyez l’intérieur du tube avec une lingette non pelucheuse pour enlever toute la graisse de la paroi du tube.
- Ajouter 10 mL d'albumen sérique humain à 2 % dans la solution saline équilibrée de Hank (HSA HBSS à 2 % [sans Ca2+ ou Mg+]). Remettre la pastille en suspension par pipetage doux pour éviter l’activation cellulaire et l’apoptose. Transférer dans un tube de 15 mL et centrifuger à 450 x g pendant 10 min.
- Videz le surnageant et répétez l’étape 1.3. Ensuite, remettre doucement les cellules en suspension dans 1 à 2 mL de HSA HBSS à 2 % en fonction du nombre de cellules attendu, et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé, en notant également la viabilité cellulaire.
4. Dosage ADCP
NOTE : Les méthodes décrites ici sont adaptées d’Ackerman et al.
- Ajouter 50 000 cellules BM fraîchement isolées dans chaque puits de plaque de test ADCP dans 200 μL de HSA-HBSS à 2 %. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
- Pour les expériences de contrôle, pré-incuber des cellules à 37 °C avec un inhibiteur d’actine de 10 μg/mL (cytochalasine-D), un agent bloquant du récepteur Fc de 50 μg/mL (FcBlock), ou une combinaison des deux avant de les ajouter aux plaques.
- Plaque de centrifugation à 930 x g pendant 10 min. Ajouter 200 μL de HSA HBSS à 2 % et répéter la centrifugation. Retirez délicatement le surnageant comme à l’étape 2.7 et répétez le lavage.
- Retirer soigneusement les cellules surnageantes et coloratives pour assurer la viabilité à l’aide d’une coloration de viabilité fixable de 0,5 μg/mL (concentration finale) 450 par puits dans 50 μL de HSA HBSS à 2 %. Incuber 20 min à température ambiante dans l’obscurité. Centrifuger la plaque à 930 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant comme à l’étape 2.7. Ajouter 200 μL de HSA HBSS à 2 % et la plaque de centrifugation de nouveau, puis retirer le surnageant comme à l’étape 2.7.
- Après coloration de viabilité, colorer les cellules pour les marqueurs leucocytaires d’intérêt, en incluant au minimum une coloration spécifique de CD45 telle que le CD45 anti-souris PE (clone HI30) à une concentration optimisée (1 μg/μL dans 50 μL de 1 % BSA HBSS dans les données d’exemple).
note: Tous les marqueurs d’intérêt spécifiques à la lignée peuvent être inclus.
- Incuber 20 min à température ambiante dans l’obscurité. Centrifuger la plaque à 930 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant comme à l’étape 2.7. Ajouter 200 μL de BSA HBSS à 1 % et répéter la centrifugation. Retirer le surnageant. Fixer les cellules dans 200 μL de formaldéhyde à 0,5 % dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes ou toute la nuit à 4 °C. Réfrigérer dans l’obscurité jusqu’à l’analyse.
5. Analyse par cytométrie en flux
- Effectuez une porte initiale pour éliminer les doublets sur un tracé de diffusion directe (FSC) par rapport à la diffusion latérale (SSC) et les débris (matériau inférieur à FSC = 5000) (voir Figure 1). Utilisez un graphique SSC vs. viability stain (V450 dans ce cas) pour éliminer les cellules mortes (celles qui sont positives pour la coloration de viabilité).
- Utilisez un graphique SSC vs. CD45 pour différencier les principales classes de leucocytes (granulocytes, monocytes, lymphocytes) telles que décrites en détail.
note: Cette classification n’est que suggestive et des marqueurs spécifiques à la lignée sont nécessaires pour confirmer le type de cellule.
- Pour toutes les cellules CD45+, ou pour chaque sous-ensemble leucocytaire d’intérêt, mesurez l’activité ADCP en effectuant un contrôle avec un marqueur sur les cellules positives aux billes dans un histogramme du canal de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), où les billes fluorescentes sont détectées.
note: Les puits de contrôle négatifs dans lesquels les billes n’ont pas été ajoutées indiqueront où les cellules positives aux billes sont apparentes dans l’histogramme et donc où placer le marqueur de porte.
- Calculer les scores ADCP comme suit : (intensité de fluorescence médiane [IMF] des cellules positives aux billes positives) x ( % du total des cellules CD45+ dans la population positive). Utilisez un logiciel graphique pour tracer les scores à chaque concentration d’Ab/sérum et pour effectuer une analyse de l’aire sous la courbe (AUC).
note: L’ADCP est considéré comme positif si l’AUC est supérieure à 3x l’écart-type de l’AUC du score ADCP d’un mAb témoin négatif non spécifique (dans ce cas, 3865).
