Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des cellules immunitaires à partir de la rate de souris
REMARQUE : Euthanasier des souris naïves avec de l’euthanasie au dioxyde de carbone (CO2). Les souris C57BL/6 achetées aux Jackson Laboratories et élevées en interne sont utilisées pour des expériences à l’âge de 6 à 12 semaines. Des souris mâles et femelles sont utilisées pour des expériences.
- Désinfectez la peau de la souris avec de l’éthanol à 70 % afin de réduire la possibilité que des contaminants externes pénètrent dans l’échantillon.
- Disséquez la rate de la souris à l’aide d’outils de dissection, de ciseaux chirurgicaux et de forceps. Récoltez la rate et placez la rate détachée dans un tube conique de 50 mL avec ~5 mL de support complet du Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) sur de la glace.
note: L’IPRR complet est composé de 10 % de sérum de veau fœtal, de 2 mM de L-glutamine et de 1 % de pénicilline/streptomycine.
- Pour récolter la rate de souris, faites une incision de 5 cm dans la fourrure et la peau le long du côté gauche de la souris à mi-chemin entre les pattes avant et arrière avec des ciseaux. Ouvrez la cavité corporelle de ~5 cm et retirez la rate à l’aide d’une pince. La rate est de la couleur d’un haricot rouge et est plus longue et plus plate que le rein voisin.
- Versez le contenu de l’étape 1.2 sur un filtre stérile de 70 μm fixé à un nouveau tube conique de 50 mL. Séparer mécaniquement la rate en une suspension unicellulaire en poussant la rate à travers le filtre à l’aide d’un piston de seringue de 5 mL jusqu’à ce qu’il ne reste plus de pulpe de rate à la surface du filtre.
- Granulez les splénocytes à l’aide d’une centrifugeuse de comptoir à rotor pivotant à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Décanter soigneusement le surnageant. Les splénocytes granulés restent au fond du tube conique de 50 mL.
- Pour éliminer les globules rouges, remettre les splénocytes en suspension dans 1 mL de tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK) pendant 3 minutes selon les instructions du fabricant. Bien mélanger.
- Trempez le tampon de lyse ACK avec 15 mL de cRPMI.
- Granulez les lymphocytes comme indiqué à l’étape 1.4.
- Remettre en suspension la suspension cellulaire dans 5 mL de cRPMI dans un tube conique de 50 mL. Placez les échantillons sur de la glace.
- Pour compter les cellules, transférez 10 μL de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 0,6 mL et diluez dans un rapport de 1:1 avec une solution de bleu de trypan. Ensuite, transférez-le vers un hémocytomètre ou un système automatisé de comptage cellulaire.
- Après le comptage, en fonction de la concentration cellulaire dans la suspension cellulaire comme à l’étape 1.9, granulez les cellules dans une centrifugeuse de table à 500 x g à 4 °C pendant 5 min pour préparer l’ajout d’un milieu cRMPI contenant un colorant ester Indo-1 AM.
- Calculez le volume de remise en suspension des cellules pour obtenir 10-12 x 106 cellules/mL. Il s’agit d’une concentration 2 fois supérieure à la numération cellulaire totale requise.
- Suspendez à nouveau les cellules dans le volume de cRPMI calculé à l’étape 1.11. Placez les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un tube conique de 50 mL avec le couvercle ventilé ou une plaque de culture tissulaire.
2. Marquage par colorant ratiométrique indo-1 et anticorps fluorescents
- Selon les instructions du fabricant, ajoutez 50 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un flacon contenant 50 μg d'Indo-1 AM. La concentration de la solution mère est de 1 μg/μL.
note: Le DMSO est fourni en micro-flacons avec le kit pour éviter toute oxydation du DMSO.
- Diluer l’aliquote mère (1 μg/μL) dans le volume expérimental approprié (établi en 1.11) de cRPMI à une concentration de 6 μg/mL, soit une concentration 2x. Ne pas stocker l’Indo-1 dans une solution aqueuse.
note: D’autres tampons avec du calcium ajouté peuvent être utilisés en fonction des besoins cellulaires.
- Réservez le milieu complet avec Indo-1 dans un bain-marie à 37 °C.
note: Utilisez la concentration minimale d’ester Indo-1 AM nécessaire pour obtenir un signal adéquat. Celle-ci doit être titrée pour différents types de cellules. En règle générale, une concentration comprise entre 3 et 5 μM est suffisante. Pour les lymphocytes T primaires, le chargement des cellules avec de l’Indo-1 à une concentration de >5 μg/mL augmente l’intensité moyenne de la fluorescence (MFI) au-dessus d’un log de 6 sur les cytomètres en flux spectral. Si cela se produit, diminuez l’intensité du laser ultraviolet (UV) et titrez l’Indo-1 à une concentration plus faible.
- Diluer la suspension cellulaire préalablement préparée (à l’étape 1.12), 1:1 dans du cRPMI, y compris le milieu 2x Indo-1 fabriqué à l’étape 2.2. S’assurer que les cellules sont à une concentration comprise entre 5 et 6 x 106/mL.
note: Ne chargez pas de colorants non colorés avec Indo-1 pour un contrôle de coloration unique ou de marqueurs de surface. L’ajout d’Indo-1 aux contrôles d’anticorps à coloration unique créera un échantillon multicolore en raison de l’ajout d’Indo-1 aux cellules à coloration unique. Inclure l’acide tétraacétique (EGTA) d’éthylène glycol indo-1 (sans calcium) ajouté au contrôle ajouté à la plaque d’échantillon créée à l’étape 2.6.
- Ajouter 1 mL de cellules/puits/conditions expérimentales dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits.
- Créez un témoin monocoloré pour l’échantillon d’Indo-1 (sans calcium) à l’aide de cellules préalablement chargées de colorant Indo-1 et ajoutez EGTA à une concentration finale de 2 mM. EGTA chélate le calcium dans la suspension cellulaire, ce qui donne un échantillon de contrôle plus propre.
- Créez un contrôle positif Indo-1 (lié à l’Indo-1 calcium) en ajoutant 50 μM d’ionomycine à la suspension cellulaire chargée de colorant au niveau du cytomètre en flux. L’ionomycine est un ionophore de calcium perméable à la membrane qui lie les ions calcium et facilite le transfert des ions calcium dans les cellules.
- Créez un puits pour le contrôle biologique négatif sans fluorophores ni colorant Indo-1.
- Créez un puits pour des contrôles à coloration unique pour toute population cellulaire supplémentaire d’intérêt (anticorps définis par l’utilisateur) à l’aide de fluorophores conjugués d’anticorps dans une conception de panel de cytométrie en flux. Ceux-ci n’incluront pas le colorant ratiométrique Indo-1.
- Ajouter l'anticorps bloquant le récepteur Fc (~2 μg/1 x 106 cellules), conformément aux instructions du fabricant, avant d'ajouter des anticorps conjugués au fluorochrome supplémentaires pour la coloration de surface.
- Incuber la plaque pendant 45 min à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Remettez les cellules en suspension dans une plaque à 12 puits en tapotant doucement la plaque toutes les 15 minutes.
- Mélangez et retirez tout le volume des cellules en suspension dans le milieu de la plaque à 12 puits. Ajoutez ensuite la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de 1,7 ml.
- Granulez les cellules dans une microcentrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à température ambiante. Décantez le surnageant et lavez les cellules en ajoutant 1 mL de cRPMI préchauffé. Granulez à nouveau et décantez le surnageant.
note: Le lavage des cellules permet d’éliminer tout anticorps bloquant Fc restant.
- Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de cRPMI dans des tubes de microcentrifugation de 1,7 mL et incuber chaque tube à 37 °C pendant 30 minutes supplémentaires à 5 % de CO2, en laissant le haut du tube légèrement ouvert pour permettre l’échange gazeux. Cela permet une désestérification complète des esters AM intracellulaires.
- Transférez les cellules dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits, si nécessaire. Des anticorps supplémentaires titrés conjugués au fluorochrome définis par l’utilisateur peuvent être ajoutés lors d’une phase de repos.
note: Les marqueurs utilisés dans le panel de méthodes comprennent : Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 et CD1d/α-galcer tétramère. Les marqueurs sont choisis pour analyser les sous-ensembles de cellules T.
- Créez un mélange maître de tous les anticorps conjugués au fluorochrome définis par l’utilisateur en fonction des types de cellules d’intérêt à un volume préalablement titré dans un tube de microcentrifugation de 1,7 ml.
- Ajouter un mélange maître calculé pour 1 mL du volume cellulaire, en fonction des anticorps titrés dirigés vers les cellules au repos.
note: L’avantage de la coloration à l’étape 2.15 au lieu de l’étape 2.18 est que la coloration à l’étape 2.15 réduira le temps d’incubation global de l’expérience. Cependant, la coloration dans un volume total de 1 mL à l’étape 2.15 augmente l’utilisation d’anticorps.
- Après le repos, granulez les cellules à 500 x g pendant 5 min à température ambiante.
note: Les cellules d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits peuvent être granulées dans la plaque à l’aide d’un accessoire de centrifugeuse à plaque. Sinon, granulez les cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,7 ml.
- Lavez les cellules en remettant la pastille en suspension dans 1 mL de cRPMI froid à 4 °C et granulez à nouveau les cellules comme à l’étape 2.16. Placez les cellules sur de la glace.
note: Si les cellules de coloration de surface sont séparées, après la désestérification à l’étape 2.18, il faut réduire le volume d’anticorps. La coloration de surface à cette étape peut être effectuée après la phase de repos dans un tampon d'écoulement froid (1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) avec 1 % de FBS ajouté), à l'aide d'anticorps définis par l'utilisateur, sur de la glace pendant 30 min. Lavez les cellules après la coloration dans cRPMI comme à l’étape 2.17.
- Ajouter la teinture de viabilité Ghost540 diluée 1:7 500 dans DPBS aux échantillons selon les instructions du fabricant. La chaleur tue les cellules à 55 °C sur un bloc chauffant pour un contrôle vivant/mort monocoloré.
note: La coloration fonctionnelle de la viabilité pour éliminer les cellules mortes dans l’analyse cytométrique en flux est effectuée sans FBS. Le FBS peut interagir avec les colorants aux amines selon les instructions du fabricant.
- Remettre en suspension des échantillons individuels dans 500 μL de cRPMI (sans rouge de phénol) à l’aide d’un tube d’écoulement en polystyrène de 5 mL avec un capuchon.
note: Les cellules peuvent être laissées à 4 °C pendant une heure maximum.
- Réchauffer chaque tube de 5 mL contenant des cellules, individuellement, à 37 °C à l’aide d’un bain de billes pendant 7 minutes avant l’analyse sur le cytomètre en flux, en maintenant un temps constant entre les échantillons. Utilisez une minuterie.
3. Tube de bain de billes : maintien de la température pendant l’analyse du flux de calcium
- Ajoutez des perles de bain dans un petit bain-marie sans ajout d’eau ; réchauffez-le à 37 °C.
- Coupez soigneusement un tube conique de 50 ml en deux, à l’aide d’une lame de rasoir, à l’aide d’une lame de rasoir ; jetez le haut du tube.
- Remplissez le tube coupé en deux aux 3/4 avec des perles de bain.
- Placez le tube créé à l’étape 3.2 dans le bain de perles créé à l’étape 3.1. Portez le tube et les billes à 37 °C.
- Branchez le bain de billes dans une prise électrique à côté du cytomètre en flux afin de maintenir la température en préparation de l’analyse de l’échantillon.
- Ajoutez une grille conique en polystyrène de 50 ml découpée pour maintenir un tube afin de positionner le tube en place pendant qu’il fonctionne sur le cytomètre en flux. Cela éliminera le besoin de tenir manuellement le tube pendant la durée de l’analyse de la courbe.
