Évaluation de l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T à l’aide d’un colorant indicateur de calcium

Résumé

Source : Perrenoud, L. et al., Analyse de l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet.J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo analyse l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T dans les lymphocytes T. Les anticorps anti-CD3 activent les voies de signalisation des lymphocytes T, entraînant une augmentation des ions calcium intracellulaires qui se lient au colorant Indo-1. En cytométrie en flux, un changement de spectre de l’état sans calcium à l’état lié au calcium est corrélé à l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des cellules immunitaires à partir de la rate de souris

REMARQUE : Euthanasier des souris naïves avec de l’euthanasie au dioxyde de carbone (CO₂). Les souris C57BL/6 achetées aux Jackson Laboratories et élevées en interne sont utilisées pour des expériences à l’âge de 6 à 12 semaines. Des souris mâles et femelles sont utilisées pour des expériences.

1. Désinfectez la peau de l....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12 plaques bien traitées TC	Traitement cellulaire	229111
50 mL conique	Biographie de Greiner1	Référence 41-12-17-03	Tubes de centrifugation en polypropylène de 50 mL avec capuchon
Tubes d’écoulement en polystyrène de 5 ml	Corning	352052
Seringue de 5 ml	Seringue BD	309646	Le piston seul est utilisé, Sheith est jeté
Filtre 70uM	Greiner bio1	Référence 542070
aCD3 (17A2)	Biolégende	100202
Tampon de lyse AKC	Gibco	A1049201
Cytomètre en flux spectral Aurora	https://cytekbio.com/pages/aurora
Perles de bain	Coleparmer	Produit # UX-06274-52
CD19 PE	Le tonbo	Référence 50-0193-U100
Tétramère CD1d APC	Nih
CD25 PECy7	Ebioscience	Référence 15-0251
CD4 APC Cy7	Le tonbo	Référence 25-0042-U100
CD8a FITC	Ebioscience	Référence 11-0081-85
Incubateur cellulaire	Scientifique formel
Pince à outils de dissection	Mckesson	#487593	Pince à tissus McKesson Adson 4-3/4 pouces de longueur en acier inoxydable non stérile non verrouillable poignée de pouce 1 x 2 dents
Outils de dissection Ciseaux	Mckesson	#970135	Ciseaux opératoires McKesson Argent™ 4-1/2 pouces en acier inoxydable de qualité chirurgicale Poignée à anneau Pointe pointue droite / pointe pointue
DPBS 1x	Gibco	Référence 14190-136	Le
EGTA	pêcheur	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lot AE29165301
Logiciel FlowJo	https://www.flowjo.com/
Colorant ester Indo1-AM	Ebioscience	Référence 65-085-39	Colorant de charge de calcium
L’ionomycine	Millipore	407951-1 mg
Fantôme vivant/mort 540	Le tonbo	Référence 13-0879-T100
Tubes de microcentrifugation 1,7 ml	Laboratoires de lumière	A-7001
Pénicilline/Streptomycine/L-Glutamine	Gibco	Référence 10378-016
Réf. PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Anti-souris purifié CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)	Le tonbo	Référence 70-0161-M001	Bloc FC
RPMI	Gibco	1875093	+ rouge phénol
RPMI sans phénol	Gibco	11835030	-rouge phénol
Centrifugeuse de table	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	Ebioscience	Tél. : 45 5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	Ebioscience	Tél. : 15-5961-82
Pack de réactifs Vi-Cell Blu		N° de produit : C06019	Comprend Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Bain d’eau	Fisher Brand Bain sec