Un test pour quantifier la liaison des VLP du norovirus humain aux bactéries intestinales

Résumé

Source : Madrigal, J. L., et al. Quantification des particules de type virus du norovirus humain se liant aux bactéries commensales à l’aide de la cytométrie en flux. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo présente un test permettant de quantifier la liaison de particules de type virus (VLP) de norovirus humains à des bactéries intestinales humaines. Les suspensions bactériennes sont mélangées aux VLP et incubées pour permettre la formation de complexes VLP-bactéries. Les complexes sont ensuite marqués avec des anticorps spécifiques aux VLP marqués au fluorophore, suivis d’une visualisation et d’une quantification basées sur la cytométrie en flux pour identifier le pourcentage de bactéries liées aux VLP.

Protocole

1. Essai de fixation des bactéries VLP

ATTENTION : Les VLP du norovirus humain présentent un danger de niveau de biosécurité (BSL)-2, et tous les travaux impliquant des VLP doivent être effectués dans une enceinte de biosécurité. La préparation des cultures bactériennes avant l’essai de fixation doit être effectuée dans des conditions de sécurité appropriées pour l’organisme.

1. Préparation des réactifs
   1. 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
      1. Préparez 1 L de PBS 10x en dissolvant un sachet dans 1 L d’eau désionisée (DI).
      2. Solution d’autoclave pendant 30 min.
      3. Préparez une solution 1x en diluant la solution ci-dessus 1:10 dans de l’eau DI.
      4. Filtre : stérilisez la solution en la passant dans un filtre de 0,22 μm et en la stockant à température ambiante.
   2. 5 % BSA
      1. Ajouter 5 g de poudre d’albumine sérique bovine (BSA) à 100 mL de PBS pour générer une solution à 5 % (p/v).
      2. Mélangez la solution par vortex ou à l’aide d’une barre d’agitation en métal sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que les grumeaux se soient dissous.
      3. Stériliser par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
      4. Conserver la solution à 4 °C.
   3. Tampon de coloration par cytométrie en flux (FCSB)
      1. Filtre acheté FCSB (voir tableau des matériaux) à travers un filtre de 0,22 μm.
      2. Conserver le reste de la solution à 4 °C.
   4. Tampon de blocage (BB)
      note: Préparez frais à chaque fois.
      1. Ajouter 0,5 g de BSA à 10 mL de FCSB stérile.
      2. Vortex pour bien mélanger l’échantillon et laisser sur de la glace jusqu’à utilisation.
2. Conjugaison d’anticorps
   1. Conjuguez l'anticorps GII du norovirus humain (voir le tableau des matériaux) avec la r-phycoérythrine (PE) à l'aide d'un kit d'étiquetage d'anticorps R-PE conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
   2. Conservez l’anticorps conjugué dans l’obscurité à 4 °C pour une utilisation future dans le test de fixation VLP-bacterium analysis.
      note: L’anticorps primaire doit être titré avant d’être utilisé dans le test de fixation VLP-bactéries afin de déterminer la concentration appropriée nécessaire pour l’analyse par cytométrie en flux. Le titrage des anticorps doit être effectué chaque fois que la réaction de conjugaison est effectuée et pour chaque bactérie utilisée dans le test d’attachement.
3. Titrage des anticorps
   1. Diluer 100 fois l’anticorps anti-norovirus humain GII, avec une dilution initiale de 1:100 et une dilution finale de 1:600 (six dilutions au total).
   2. Effectuez un test de fixation du virus comme décrit ci-dessous, à l’exception de ce qui suit : à l’étape 1.5.7, remettre la pastille bactérienne en suspension dans 350 μL de BB à 5 %.
   3. Divisez l’échantillon en sept aliquotes de 50 μL.
   4. Ajouter 50 μL de chaque dilution d’anticorps dans un tube.
   5. Ajouter 50 μL de BB à 5 % dans le septième tube comme témoin non coloré.
   6. Effectuez une cytométrie en flux sur tous les échantillons comme décrit ci-dessous.
   7. Comparez les échantillons d’anticorps dilués aux témoins non colorés et les uns aux autres. La concentration d’anticorps la plus faible qui n’entraîne pas de diminution ou de perte du signal positif doit être choisie pour les tests ultérieurs.
4. Préparation des bactéries
   1. Cultivez les bactéries dans 40 ml de milieu liquide approprié dans des conditions atmosphériques appropriées jusqu’à ce que les bactéries soient en phase stationnaire.
      1. Cultivez des cultures d’Enterobacter cloacae en aérobie pendant la nuit dans un bouillon Luria à 37 °C, en secouant à 200 tr/min pour atteindre la phase stationnaire.
      2. Cultivez des cultures de Lactobacillus gasseri dans des bouillons De Man, Rogosa et Sharpe (MRS) dans des tubes à bouchon à vis noirs sans agiter dans un bain-marie réglé à 37 °C pendant 18 h pour atteindre la phase stationnaire.
   2. Transférez les cultures en phase stationnaire dans des tubes coniques propres de 50 mL et centrifugez des échantillons à 2 288 x g pendant 10 minutes pour granuler les bactéries.
   3. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 13 mL de PBS stérile. Répétez cette étape de lavage pour un total de deux lavages.
   4. Centrifuger à nouveau les échantillons, retirer le surnageant et remettre les échantillons en suspension dans 20 mL de 1x PBS.
      note: Si la pastille de cellule est petite, le volume de remise en suspension peut être diminué.
   5. Mesurez la DO₆₀₀ de la culture.
   6. À l’aide d’une courbe standard, déterminez l’unité formant colonies (UFC) par mL de la culture lavée.
   7. Diluer les bactéries avec 1x PBS pour ajuster la concentration de la culture à 1 x 10⁸ UFC/mL.
   8. Transférez 1 mL de la culture bactérienne 1 x 10⁸ UFC/mL dans les tubes à centrifuger requis de 1,5 mL.
   9. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 5 min.
   10. Remettre la pastille bactérienne en suspension dans 1 mL de BSA stérile à 5 %.
   11. Incuber les tubes pendant 1 h à 37 °C avec une rotation constante.
5. Pièce jointe de virus
   1. À l’intérieur d’une enceinte de biosécurité BSL-2, ajoutez 10 μg de VLP de norovirus humain (HuNoV) (voir le tableau des matériaux) dans chaque tube contenant des bactéries remises en suspension dans le PBS et mélangez soigneusement par pipetage.
      note: La concentration de VLP diffère selon chaque préparation de VLP. Par conséquent, le volume ajouté aux bactéries variera d’un lot de préparation à l’autre et doit être ajusté en conséquence de sorte que 10 μg soient ajoutés à chaque tube de l’expérience. Pour les témoins ciblant uniquement des bactéries (p. ex., échantillons sans PPV), ajoutez un volume de PBS égal au volume de PPV ajouté aux échantillons expérimentaux.
   2. Incuber les tubes pendant 1 h à 37 °C avec rotation constante.
      REMARQUE : Un revolver tubulaire (voir Tableau des matériaux) réglé à 40 tours est utilisé pendant l’incubation.
   3. Après l’incubation, centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min.
   4. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille bactérienne dans 1 mL de PBS.
   5. Répétez les étapes de lavage 1.5.3 et 1.5.4.
   6. Centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min.
   7. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille bactérienne dans 150 μL de BB à 5 %.
6. Coloration des anticorps
   1. Préparez des produits frais 5 % BB.
      REMARQUE : Tous les travaux utilisant l’anticorps marqué par fluorescence doivent être effectués dans l’obscurité, et l’anticorps, le BB et le FCSB doivent être conservés sur de la glace.
   2. Diluer l’anticorps GII du norovirus humain 1:125 pour les échantillons d’E. cloacae et 1:150 pour les échantillons de L. gasseri dans des BB à 5 %, en préparant 50 μL d’anticorps dilués par échantillon.
   3. Diluer l’anticorps isotype de la même manière que l’anticorps anti-norovirus humain GII a été dilué pour chaque bactérie dans 5 % BB, en préparant 50 μL de contrôle d’isotype dilué par échantillon.
   4. Diviser chaque échantillon d’essai d’accessoire de l’étape 1.3.7 en trois aliquotes de 50 μL en les transférant dans des tubes à centrifuger propres de 1,5 mL.
   5. À la première série d’échantillons, ajoutez 50 μL de BB. Cet ensemble sera les commandes non tachées (Uns).
   6. Ajouter 50 μL de dilution de l’anticorps GII à la deuxième série. Il en résulte une concentration finale d’anticorps de 1:250 pour E. cloacae et de 1:300 pour L. gasseri. Cet ensemble d’échantillons sera les échantillons colorés (AB).
   7. Ajouter 50 μL de l’anticorps isotype dilué à la troisième série. Cet ensemble sera les commandes d’isotype (IC). Bien mélanger par pipetage. Incuber les échantillons sur de la glace et dans l’obscurité pendant 30 min.
   8. Centrifuger tous les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min.
   9. Jeter le surnageant et remettre les échantillons en suspension dans 100 μL de FCSB.
   10. Centrifuger tous les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre les échantillons en suspension dans 100 μL de FCSB.
   11. Centrifuger tous les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min.
   12. Jeter le surnageant et remettre les échantillons en suspension dans 150 μL de FCSB.
   13. Transvaser chaque échantillon dans un tube FCSB contenant 400 μL de tampon FCSB pour un volume total de 550 μL.
   14. Conserver les échantillons à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient analysés par cytométrie en flux.
       note: La cytométrie en flux est effectuée dans les 4 heures suivant la coloration des anticorps.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes en polystyrène à fond rond de 5 ml avec capuchon de filtre cellulaire	Corning	352235	Après la coloration des anticorps, l’échantillon est transféré dans des tubes pour une analyse par cytométrie en flux.
AnaeroPack	Thermo Scientific	R681001	Bloc de gaz anaérobie utilisé pour la culture de Lactobacillus gasseri
Logiciel BD FacsDiva
Cytomètre en flux BD LSR Fortessa
Albumine sérique bovine	Bioréactifs Fisher	BP1605	Utilisé pour la cytométrie en flux
Tampon de coloration par cytométrie en flux (FCSB)	BD Biosciences	554657	Utilisé pour la cytométrie en flux
Contrôle de l’isotype IgG2b kappa de souris (eBMG2b), PE, eBioscience	Thermo Fisher Scientific	12473281	Contrôle des isotypes. Cet anticorps est acheté sous forme conjuguée auprès du fabricant.
MRS Poudre	BD Biosciences	Référence 288130	Utilisé pour la préparation des milieux et pour la culture de Lactobacillus gasseri.
Anticorps monoclonal G2 de la capside du norovirus (L34D)	Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	Anticorps anti-norovirus GII. Cet anticorps n’est disponible que sous forme non conjuguée et doit donc être conjugué par fluorescence avant d’être utilisé dans les tests de cytométrie en flux décrits. Dans ce protocole, le PE a été choisi comme fluor, cependant, d’autres molécules fluorescentes peuvent être choisies comme étant les mieux adaptées au cytomètre en flux utilisé par le chercheur.
Norovirus GII.4 VLP	Biostructure créative	Réf. CBS-V700	Les VLP ont été générées à l’aide du système baculovirus et remises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate avec 10 % de glycérol. Les auteurs ont effectué une analyse indépendante de suivi par nanovisée pour déterminer la concentration de particules des VLP. La concentration est d’environ 1011 VLP par millilitre. D’après la concentration en protéines des VLP, environ 200 particules sont ajoutées par bactérie dans les essais de fixation des VLP.
PBS 10X	Bioréactifs Fisher	BP665	Diluer à 1X avant utilisation.
Kit d’étiquetage d’anticorps SiteClick R-PE	Thermo Fisher Scientific	S10467	Kit de conjugaison utilisé pour l’étiquetage des anticorps non conjugués.
chlorure de sodium	Fisher Scientific	S271	Utilisé pour la préparation des supports
Tryptone	Oxoïde	Réf. LP0042	Utilisé pour la préparation des supports
Revolver à tube	ThermoFisher Scientific	88881001	Utilisé dans le test de fixation virus :bactérie. Réglez sur la vitesse maximale (40 tr/min).
Extrait de levure	BD Biosciences	Référence 212750	Utilisé pour la préparation des supports
agar-agar	sigma	A7002	Utilisé pour la préparation des supports