1. Détection de la mitophagie chez C. elegans
REMARQUE : Le nématode C. elegans fournit une plate-forme pour tester la mitophagie au niveau de l’organisme. Deux souches peuvent être utilisées pour surveiller la mitophagie : (1) Rosella ciblée sur les mitochondries (mtRosella) ou (2) le récepteur de la mitophagie DCT-1 fusionné avec la GFP avec le marqueur autophagosomal LGG-1 fusionné avec Discosoma sp. protéine fluorescente rouge (DsRed).
- Surveillance de la mitophagie à l’aide du biocapteur Rosella
REMARQUE : Rosella est un biocapteur moléculaire qui combine un DsRed insensible au pH fusionné à une variante GFP sensible au pH. Le biocapteur Rosella tire parti des différences de pH entre le lysosome acide (pH ~4,5) et les autres compartiments cellulaires. Ce biocapteur a été utilisé pour surveiller avec succès la mitophagie chez Saccharomyces cerevisiae et plusieurs lignées cellulaires de mammifères, telles que HeLa, HEK293 et HCT116. Nous avons adapté ce rapporteur polyvalent à double fluorescence et généré des nématodes transgéniques C. elegans exprimant Rosella ciblant les mitochondries (mtRosella) dans les cellules musculaires de la paroi corporelle. L’induction de la mitophagie est indiquée par un rapport GFP/DsRed réduit de la fluorescence mtRosella.
- Jour 1 : Prélever des larves L4 de vers exprimant Rosella ciblée sur les mitochondries (mtRosella) dans les cellules musculaires de la paroi corporelle sur une plaque de milieu de croissance de nématode (NGM) ensemencée d’E. coli (OP50) à l’aide d’un microscope de dissection. Placez 10 à 20 vers/assiette sur au moins trois assiettes de 3,5 cm. Incuber les nématodes à la température standard de 20 °C.
note: Voir la référence pour l’anatomie du ver, y compris l’identification des larves L4, et la façon de faire une pioche qui est utilisée pour transférer les vers d’un endroit à un autre.
- Jour 5 : Synchroniser les nématodes en sélectionnant 15 à 20 larves transgéniques L4 et en les transférant sur une plaque NGM fraîche ensemencée d’OP50. Utilisez au moins cinq plaques par condition expérimentale.
- Jour 7 : Préparez les plaques d’immatriculation des véhicules pour les médicaments d’intérêt affectant la mitophagie ou les témoins positifs.
- Tuez les bactéries E. coli (OP50) ensemencées en exposant les plaques NGM pendant 15 minutes avec 222 μW/cm2 (intensité) de lumière UV pour s’assurer que les composés induisant la mitophagie ne sont pas métabolisés par les bactéries. Les plaques doivent être exposées avec 2 000 J/m2.
REMARQUE : Secondes d’exposition nécessaires = 2 000/((intensité en μW/cm2)*100).
- Ajoutez le(s) composé(s) d’intérêt au(x) haut(s) des plaques NGM ensemencées. Ajouter une quantité équivalente de véhicule composé (solvant utilisé pour dissoudre le composé, tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO)) aux plaques du véhicule en tant que témoin négatif. Pour le contrôle positif de l’induction de la mitophagie, un toxique mitochondrial, le paraquat (concentration finale de 8 mM), a été utilisé. Ajouter une solution contenant 10 μL de stock de paraquat 8 M avec 190 μL de ddH2O sur le dessus de la plaque de gélose pour le groupe de traitement. Pour le groupe de véhicules, ajouter une solution contenant 10 μL de DMSO avec 190 μL de ddH2O sur le dessus de la plaque de gélose.
note: La solution pour le travail du paraquat peut être conservée pendant 1 mois à 4 °C.
- Faites tourner doucement les plaques jusqu’à ce que le médicament ou le véhicule recouvre toute la surface. Laissez sécher les plaques avec les couvercles fermés à température ambiante pendant au moins 1 h avant de transférer les vers.
note: Les plaques de médicaments peuvent également être préparées en ajoutant des médicaments dans le NGM liquide avant qu’il ne se solidifie.
- Jour 7 : Transférer 10 à 20 animaux transgéniques adultes âgés de 2 jours préparés à l’étape 2.1.2 dans des plaques contenant du paraquat, un ou des composés d’intérêt ou un véhicule (DMSO). Incuber les animaux transgéniques à 20 °C pendant 2 jours.
- Jour 9 : Préparez des coussinets d’agarose à 2 %. Ajouter ensuite une gouttelette (10 μL) de 20 mM de lévamisole en M9 par tampon. Immobiliser les animaux transgéniques pour l’imagerie, en les plaçant dans la goutte M9-lévamisole. Placez délicatement une lamelle sur le dessus.
- Capturez des animaux transgéniques uniques à l’aide d’une caméra fixée à un microscope à épifluorescence. Acquérir des images fluorescentes de nématodes transgéniques entiers exprimant mtRosella dans les cellules musculaires de la paroi corporelle à un grossissement de 10X. Enregistrez les images collectées.
- Traitez les images acquises avec le logiciel ImageJ. Analysez les cellules musculaires de la paroi corporelle situées dans la tête du ver pour éviter l’autofluorescence dans le tissu intestinal. Mesurez la valeur moyenne de l’intensité des pixels et la surface totale pour chaque image fluorescente uniquement de la région de la tête de chaque animal. Pour analyser la zone d’intérêt spécifique :
- Sélectionnez « Split channel » dans le menu déroulant « image » et « color » pour convertir les images.
- Utilisez l'outil de « sélection à main levée » pour capturer la zone fluorescente d'intérêt.
- Sélectionnez la commande « mesure » dans le menu déroulant « analyser » et effectuez une analyse de l'intensité des pixels.
- L’intensité des pixels doit être normalisée en divisant l’intensité par la surface totale analysée. Lors de la normalisation, calculez le rapport GFP/DsRed.
- Utilisez un logiciel d’analyse statistique pour effectuer un test t d’étudiant (comparaison entre deux groupes) ou une ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour une analyse statistique avec p < 0,05 comme significatif.
- Évaluation de la mitophagie à l’aide de la co-localisation entre DCT-1 et LGG-1
REMARQUE : DCT-1 est une protéine de la membrane mitochondriale externe qui agit comme un récepteur de mitophagie en réponse à des conditions de stress, similaire à ses orthologues présumés BNIP3 et NIX/BNIP3L chez les mammifères. Ainsi, l’initiation de la mitophagie est évaluée par co-localisation entre le récepteur de la mitophagie DCT-1 et la protéine membranaire autophagosomale LGG-1 (homologue de la LC3 du mammifère).
- Jour 1 : Prélever des larves L4 d’animaux transgéniques exprimant à la fois DCT-1 ::GFP et DsRed ::LGG-1 dans les cellules musculaires de la paroi corporelle5 sur une plaque NGM ensemencée OP50. Placez 5 à 10 vers/plaque de 3,5 cm et utilisez au moins trois assiettes. Incuber les nématodes à 20 °C
note: Les transgènes sont situés sur des plasmides séparés et ils ne sont pas intégrés dans le génome. Ramassez les nématodes porteurs des marqueurs de contransformation GFP rol-6(su1006) et pmyo-2. Seuls les vers transgéniques avec les deux marqueurs de contransformation expriment à la fois DCT-1 ::GFP et DsRed ::LGG-1 dans les cellules musculaires de la paroi corporelle.
- Suivez les étapes des sections 1.1.2 à 1.1.5.
- Imagez des cellules musculaires de la paroi d’un seul corps à l’aide d’une caméra fixée à un microscope confocal. Détectez les limites de cellules musculaires entières de la paroi corporelle et prenez des images de la pile z sous un grossissement de 63x. Un grossissement plus élevé peut également être utilisé.
- Ouvrez et traitez les images acquises avec le logiciel confocal. L’initiation de la mitophagie est indiquée par la co-localisation du récepteur de la mitophagie (DCT-1 ::GFP) par rapport au marqueur autophagosomal (DsRed ::LGG-1). Mesurez manuellement les événements de co-localisation dans chaque pile de cellules musculaires de la paroi corporelle. Il est essentiel de maintenir tous les paramètres du microscope et de l’appareil photo (objectif et loupe, filtres, temps d’exposition, résolution, intensité laser, gain, etc.) cohérents tout au long des expériences. Tous les paramètres doivent être notés.
- Utilisez un logiciel d’analyse statistique pour effectuer un test t d’étudiant (comparaison entre deux groupes) ou une ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour une analyse statistique avec p < 0,05 comme significatif. Pour les comparaisons à deux facteurs, utilisez le test t de Student (p < 0,05 est considéré comme significatif). Pour les comparaisons multiples, utilisez l’analyse de variance à facteur unique (ANOVA), corrigée par le test de Bonferroni a posteriori. Nous recommandons d’analyser au moins 50 à 70 animaux ou 30 à 50 cellules musculaires de la paroi corporelle pour chaque condition expérimentale. Répétez l’expérience au moins trois fois.
