Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation des tampons et des réactifs
REMARQUE : Préparez tous les échantillons conformément aux directives du fabricant. Au cours de cette procédure, portez un équipement de protection individuelle (blouses de laboratoire, gants et lunettes de protection).
- Préparez le tampon de lavage du citrate en combinant 0,941 g de saccharose (concentration finale de 11 mM), 6,4 mL de chlorure de sodium 5 M (NaCl, 128 mM final), 5,4 mL de phosphate monosodique 0,2 M (NaH2PO4, 4,3 mM final), 9,4 mL de phosphate disodique 0,2 M (Na2HPO4, 7,5 mM final), 0,352 g de citrate de sodium (4,8 mM final), et 0,115 g d’acide citrique (2,4 mM final). Ajustez le volume total à 250 mL avec du jdH2O. Filtrez à travers un disque filtrant de 0,45 μm et ajustez le pH à 6,5. Conserver jusqu’à 1 an à 4 °C. Amener la solution à température ambiante (RT) avant utilisation.
- Préparez le tampon de rupture en combinant 250 mM de saccharose, 1 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) et 10 mM de chlorhydrate d’aminométhane Tris (hydroxyméthyle) (Tris-Cl, pH 7,4) dans un volume final de 100 mL. Conserver jusqu’à 1 an à 4 °C. Ajouter 2 μL de cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase (1:1000 final) et 1 μL de cocktail d’inhibiteurs de protéase (1:2000 final) dans 2 mL de tampon de rupture. Garder sur la glace jusqu’à utilisation. Jetez le tampon de rupture non utilisé.
2. Isolement plaquettaire
- Prélever 8 à 10 mL de sang humain dans un tube de prélèvement sanguin à capuchon jaune contenant une solution d’acide-citrate-dextrose (ACD) (75 mM de citrate trisodique, 124 mM de dextrose et 38 mM d’acide citrique, pH = 7,4 ; ACD : sang = 1:9). Mélangez délicatement le contenu du tube 5x–6x en inversant à la main.
- Centrifuger les tubes à 200 x g dans un rotor à godets oscillants pendant 20 min à RT.
- Prélever du plasma riche en plaquettes (PRP) (~3 à 4 ml) dans un tube à fond conique de 15 ml et laisser environ 0,5 ml de PRP de la couche leucocytaire (fraction d’apparence trouble) pour éviter la contamination. En cas de contamination par des globules rouges, répétez cette étape.
- Centrifuger les échantillons de PRP à 1 200 x g pendant 15 min à RT.
- Laver les pastilles de plaquettes (P1) par remise en suspension douce dans 1 mL de tampon de lavage de citrate et les granulés par centrifugation à 1 200 x g pendant 15 min à RT.
- Conservez la pastille de plaquettes pure. Jetez le surnageant.
- Remettre les pastilles plaquettaires en suspension dans 600 μL du tampon de rupture contenant des cocktails inhibiteurs.
- Soniquer la suspension plaquettaire à l’aide d’un sonicateur. Placez l’échantillon dans un mini seau à glace. Réglez le sonicateur sur le réglage 3 pendant 20 s en mode continu.
REMARQUE : Nettoyez la sonde avec 10 % d’eau de Javel suivie d’eau distillée.
- Centrifuger les échantillons soniqués à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer les fractions membraneuses. Aliquote surnageants dans 60 μL et conserver à -80 °C. Évitez les cycles répétés de décongélation/congélation des fractions cytosoliques plaquettaires.
3. Préparation pour l’immunodosage par électrophorèse capillaire (CEI)
REMARQUE : 100 μL de lysat de plaquettes humaines ont été combinés chez des patients atteints de SLA (n = 8-10), et des sujets sains (n = 8-10) ont été regroupés séparément et utilisés pour l’optimisation du test.
- Remplissez des modèles générés en interne pour la mise en page de l’IEC (tableau 1) et la préparation des échantillons (tableau 2). La table de préparation du mélange d’échantillons est dynamique et calcule automatiquement le volume à retirer de la source.
REMARQUE : Lorsque le volume source requis est entré dans le tableau dynamique 2, le volume de tampon d’échantillonnage de 0,1 X est automatiquement calculé.
- Pré-étiquetez 25 tubes PCR de 0,2 ml avec les capillaires #1 à #25 et placez-les dans un rack PCR. Mis sur la glace.
- Pré-étiquetez les tubes de microcentrifugation de 0,6 mL : un pour chaque anticorps primaire et dilution (si nécessaire) à utiliser, un pour le tampon d’échantillon 0,1x, un pour le luminol-S/peroxyde et un pour chaque échantillon à diluer (si nécessaire). Placez-les sur de la glace dans une grille tubulaire.
- Retirez le tampon d’échantillon, le tampon de lavage, une plaque et une cartouche fournies dans le module de séparation CEI 12-230 kDa du kit maître-jeu.
- Sortez du réfrigérateur à 4 °C le tampon de dilution des anticorps, les anticorps primaires, les anticorps secondaires, le luminol, le peroxyde d’hydrogène et l’emballage standard. Placez tous les réactifs sur de la glace à l’exception du pack standard, qui reste à RT.
REMARQUE : Les réactifs des packs standard sont lyophilisés et scellés avec un couvercle en aluminium. Pour réduire les pertes de produit, ceux-ci doivent être brièvement essorés à l’aide d’une mini-centrifugeuse avant d’être ouverts. Pour s’ouvrir, les tubes de réactifs peuvent être percés par une pointe de pipette ou retirés du coin.
- Pour préparer les 400 mM de dithiothréitol (DTT), ajoutez 40 μL d’eau désionisée dans le tube transparent contenant le DTT.
- Pour préparer 40 μL de mélange maître fluorescent 5x, ajoutez 20 μL du tampon d’échantillon 10x et 20 μL de la solution DTT préparée à 400 mM dans le tube rose fourni dans le kit.
- Pour préparer l’échelle biotinylée, ajoutez 16 μL d’eau déminéralisée, 2 μL de tampon d’échantillon 10x et 2 μL de la solution DTT préparée à 400 mM dans le tube blanc fourni dans le kit. Mélanger délicatement et transférer dans un tube de réaction en chaîne par polymérase (PCR) de 0,2 mL pour la dénaturation.
- Préparez un tampon d’échantillon 0,1x en ajoutant 1,5 μL de tampon d’échantillon 10x et 148,5 μL d’eau désionisée dans un tube de micro-centrifugeuse de 0,6 mL. Vortex pour mélanger et placer sur de la glace.
- Préparez les dilutions d’anticorps souhaitées. Ajouter le diluant d’anticorps dans les volumes désignés dans chaque tube de micro-centrifugeuse pré-étiqueté. Si les volumes sont identiques, utilisez la technique du pipetage inverse ; Si ce n’est pas le cas, pré-rincez l’embout de la pipette avant de la distribuer.
REMARQUE : L’anticorps panique A-TDP-43 et l’anticorps a-p(S409/410-2) TDP-43 ont été utilisés dans cet essai. L’anticorps anti-ERK a été utilisé pour le contrôle interne afin de s’assurer que les composants du test fonctionnaient.
- Effectuez le pipetage inverse pour la dilution des anticorps comme décrit ci-dessous. Des informations supplémentaires peuvent également être trouvées dans le site literature.
REMARQUE : Le pipetage inverse est préférable lors de la distribution de petits volumes séquentiels de solutions. Cette technique offre certains avantages : (i) fournir un volume précis, (ii) éliminer la formation de mousse de réactif dans l’orifice de la pointe, et (iii) idéale pour les réactifs de petit volume (<5 μL), les solutions visqueuses, les solutions tensioactives et les solutions à haute pression de vapeur.
- Mettez une pointe appropriée dans une pipette et appuyez sur le piston jusqu’à la deuxième butée (étape 2). Plongez la pointe de la pipette à quelques millimètres dans la solution. Relâchez lentement le piston pour remplir l’embout de la pipette avec la solution pendant que l’embout est encore immergé. Retirez l’embout de la solution et touchez-le doucement contre le bord du réservoir de réactif afin d’éliminer l’excès de liquide restant à l’extérieur de l’embout.
- Distribuez la solution en appuyant sur le piston jusqu’à la première butée (étape 1). Ne versez pas la solution restante dans l’embout.
- Videz la solution restante dans l’embout dans le réservoir de réactif en appuyant sur le piston jusqu’à la deuxième butée (étape 2). Relâchez le piston en position prête pour l’étape de pipetage suivante.
- Ajouter l’anticorps requis dans les volumes désignés dans chaque tube de microcentrifugation pré-étiqueté (tableau 1). Ne pré-rincez pas l’embout de la pipette : ajoutez-le directement dans le diluant et rincez l’embout plusieurs fois pour éliminer l’anticorps. Placez les tubes sur de la glace.
- Pour préparer le mélange d’échantillons CEI, effectuez les étapes énumérées ci-dessous pour les tubes PCR étiquetés cap#2 à cap#25 : C’est dans le même ordre que dans le tableau 1.
- Ouvrez tous les tubes, ajoutez 1,6 μL d’aliquotes de tampon d’échantillon fluorescent 5x dans chaque tube à l’aide d’une technique de pipetage inversé, puis fermez chaque tube PCR lors de l’ajout du tampon 5x pour minimiser la perte d’échantillon.
- Ouvrez tous les tubes, ajoutez à chaque tube une mémoire tampon d’échantillon de 0,1x dans les volumes indiqués dans le Tableau 2, puis fermez-le immédiatement. Si les volumes sont identiques, utilisez une technique de pipetage inversé. Si ce n’est pas le cas, pré-rincez la pointe de la pipette avant de distribuer un tampon d’échantillon 0,1x.
- Ouvrez tous les tubes, ajoutez l’échantillon de protéines dans les volumes indiqués au tableau 2 dans chaque tube, puis fermez immédiatement après. Si les volumes sont identiques, utilisez la technique du pipetage inverse. Si ce n’est pas le cas, pré-rincez la pointe de la pipette avant de distribuer un tampon d’échantillon 0,1x.
- Centrifuger brièvement tous les tubes PCR dans une centrifugeuse de paillasse (13 000 x g pendant 30 s), mélanger les tubes PCR par effleurement/vortex, puis répéter la centrifugation.
- Transférez tous les tubes PCR dans un thermocycleur avec un couvercle chauffé. Dénaturer les échantillons à une température et une durée définies (c.-à-d. 95 °C pendant 5 min ; 70 °C pendant 10 min).
REMARQUE : La température et la durée de dénaturation doivent être optimisées pour la protéine cible.
- Répétez l’étape 3.12.4.
- Remettez tous les tubes PCR dans le support de tubes et placez-les sur de la glace.
- Lors de l’étape de dénaturation, préparer la solution de développement (1:1 luminol-S : solution de peroxyde), puis ajouter 200 μL de luminol-S et 200 μL de peroxyde. Placer sur de la glace.
- Pour charger une plaque préremplie CEI avec l’échantillon préparé ci-dessus, distribuez les réactifs et les échantillons dans la plaque d’essai illustrée dans la présentation de l’essai (Figure 1). Évitez d’introduire des bulles d’air.
REMARQUE : Si les volumes et la solution sont identiques, utilisez une technique de pipetage inversé. Si ce n’est pas le cas, pré-rincez la pointe de la pipette avant de la distribuer et n’expulsez pas le reste dans le puits de la plaque à l’aide de la deuxième butée de languette de la pipette. Un module de séparation de 12 à 230 kDa peut contenir un guide de chargement de plaque à code couleur. Placez ce guide sous la plaque tout en ajoutant des réactifs et des échantillons dans le puits, ce qui facilite visuellement le chargement des échantillons. Le guide de chargement des plaques peut également être téléchargé sur le site Web de l’entreprise.
- ajouter 15 μL de mélange de luminol : peroxyde dans chaque puits de la rangée E.
REMARQUE : Idéalement, préparez ce réactif juste avant de l’utiliser et ajoutez-le dans chaque puits. Si cela ne convient pas, ce mélange ne peut être préparé plus de 30 minutes avant le chargement de la plaque.
- Dans la rangée D, au puits D1, ajoutez 10 μL de streptavidine-HRP.
- Dans la rangée D, aux puits D2 à D25, ajouter 10 μL d’anticorps secondaires désignés.
- Dans la rangée B, ajoutez 10 μL de diluant d’anticorps dans chaque puits.
- Dans la rangée C, pour bien C1, ajouter 10 μL de diluant d’anticorps.
- Dans la rangée C, aux puits C2 à C25, ajouter 10 μL d’anticorps primaires désignés.
- Dans la rangée A, au puits A1, ajoutez 5 μL d’échelle biotinylée du tube PCR #1.
- Dans la rangée A, dans les puits A2 à A25, ajoutez 3 μL de l’échantillon, tubes PCR #2 à #25 dans les puits correspondants #2 à #25.
- Ajoutez 500 μL de tampon de lavage dans chaque puits de tampon de lavage désigné.
- Centrifuger la plaque pendant 5 min à 1 000 x g à RT.
Tableau 1 : Gabarit de chargement de plaque de test CEI.
Tableau 2 : Modèle interactif de préparation de mélanges d’échantillons. Après avoir saisi la concentration en protéines de base à partir d’échantillons inconnus, les cellules interactives calculent automatiquement le volume à utiliser pour préparer le mélange d’échantillons.
