Dosage immunologique à base de nanoparticules magnétiques à l’aide d’un dispositif microfluidique

1. Préparation de l’appareil

1. Remplissez les canaux d’eau distillée à l’aide d’une seringue. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites ou de résistance à l’écoulement. Plongez l’appareil dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes pour éliminer tout reste d’acrylique, d’adhésif ou de matériau indésirable à l’intérieur des canaux.
2. Videz l’eau à l’intérieur des canaux de l’appareil. À l’aide d’une seringue, introduire une solution bloquante préparée avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % (p/v) diluée dans une solution saline 1x tamponnée au Tris (TBS) et préalablement filtrée à travers un filtre de seringue en polyéthersulfone (PES) de 0,2 μm.
3. Préparer une suspension de microparticules de fer de 7,5 μm de diamètre dans 5 % BSA.
   note: Les microparticules sont préalablement fonctionnalisées avec une couche de silice-polyéthylène glycol (PEG) qui confère une résistance à l’absorption des protéines.
4. Incuber la puce et la suspension de microparticules avec la solution de blocage pendant au moins 1 h à température ambiante. Si possible, laisser bloquer toute la nuit à 4 °C.

2. Formation de pièges à microparticules

1. Insérez les microparticules dans la puce à l’aide d’une aiguille de seringue à travers le tuyau de sortie du canal latéral. Placez la puce à la verticale et laissez les microparticules s’écouler sous l’effet de la gravité à travers le canal latéral. Faites pivoter la puce de 180° en deux étapes de 90° et laissez les microparticules cibler et se compacter à la restriction de 5 μm.
2. Éliminez l’excès de microparticules par gravité en tournant à 45° vers le canal latéral.
3. Gardez l’appareil à la verticale pour éviter de défaire le piège à microparticules. Voir la figure 1B pour un résumé du processus de formation des pièges à microparticules.

3. Dosage immunologique

1. Préparation de nanoparticules
   1. Prélever 2 μL de la suspension de nanoparticules de 100 nm préalablement conjuguées à du lysozyme (modèle antigénique). Ajoutez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec 100 μL de solution de blocage. Incuber toute la nuit à 4 °C.
   2. Ajouter 150 μL de tampon de lavage (1x TBS, 0,05 % Tween 20).
   3. Placez le tube de microcentrifugation de 1,5 mL dans un séparateur magnétique. Conserver 15 min pour permettre la séparation des nanoparticules (Figure 2).
      note: Le volume minimum du séparateur magnétique est de 200 μL. Évitez d’utiliser un volume plus petit.
   4. Retirez le liquide du tube à l’aide d’une micropipette. Évitez tout contact avec la paroi du tube où la pastille de nanoparticules s’est formée.
   5. Ajouter 250 μL de tampon de lavage frais. Gardez le tube sous agitation pendant 15 min.
   6. Répétez les étapes 3.1.3.-3.1.5 2 fois plus, en secouant seulement pendant 5 min.
   7. Ajouter la concentration souhaitée d’anticorps anti-lysozyme primaire (voir le tableau des matériaux). Ajuster à un volume final de 100 μL dans le diluant d’anticorps (1x TBS, 1 % BSA, 0,05 % Tween 20).
   8. Incuber pendant 15 min à 37 °C. Continuer à agiter pendant 15 min supplémentaires à température ambiante.
   9. Répétez les étapes de lavage 3.1.2.-3.1.6.
   10. Ajouter 100 μL de diluant d’anticorps. Ajouter l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort (HRP-AbII) (voir le tableau des matériaux) à une dilution de 1:500.
   11. Répétez les étapes de lavage 3.1.2.-3.1.6.
   12. Conservez les nanoparticules dans un volume final de 50 μL de diluant d’anticorps.

4. Montage expérimental

1. Remplissez d’eau les deux seringues en verre de 100 μL, connectez un tuyau de 6,5 cm de long à chaque seringue, insérez une goupille métallique à l’extrémité du tuyau et placez les deux seringues sur le pousse-seringue contrôlé par ordinateur.
2. Scellez tous les tuyaux de l’appareil en acrylique avec de la chaleur.
3. Coupez le tuyau d’arrivée et ne gardez que quelques millimètres. Remplissez l’aiguille de distribution avec un tampon de lavage et insérez-la dans le tuyau coupé. Laissez la solution s’égoutter avant de connecter l’aiguille à l’appareil pour empêcher l’air d’accéder à l’appareil.
4. Coupez le tuyau de sortie du canal latéral. Connectez-vous à la pompe à seringue. Ensuite, effectuez la même procédure pour le tuyau de sortie du canal principal.
   note: Il est essentiel d’effectuer les étapes 4.3.-4.4. dans cet ordre pour éviter de déballer le piège à microparticules. Si possible, vérifiez l’état du piège lors de ces étapes à l’aide d’une loupe.
5. Placez une lame de verre sur la platine du microscope. Fixez l’aimant à la diapositive avec du ruban adhésif double face et placez un petit morceau de ruban adhésif de chaque côté pour fixer les bords de la puce au verre.
6. Réglez un débit de 50 μL/h à l’aide des onglets Débit et Unités du contrôleur de la pompe à seringue. Sélectionnez le mode de retrait et cliquez sur le bouton Démarrer pour activer le flux du tampon de lavage.
7. Avec précaution, approchez l’appareil vers la glissière avec l’aimant de manière horizontale de sorte que la zone de la puce contenant le piège entre en contact avec l’aimant.
8. Collez les bords de l’appareil sur le verre avec du ruban adhésif double face pour éviter tout mouvement. Évitez d’obstruer le chemin optique pour la microscopie (Figure 1C).

5. Immunodétection

1. Maintenez le tampon de lavage pendant 10 min à 50 μL/h pour éliminer l’excès de BSA.
2. Retirez le tampon de lavage restant de l’aiguille de distribution à l’aide d’une micropipette. Ajouter 50 μL de suspension de nanoparticules.
3. Faire couler la suspension de nanoparticules pendant 7 min à un débit de 100 μL/h. Par la suite, modifiez le débit à 50 μL/h et laissez couler pendant 15 minutes supplémentaires.
4. Changez l’aiguille de distribution. Verser le tampon de lavage pendant 10 min à 50 μL/h. Préparez le substrat fluorogène selon les spécifications du fabricant pendant l'étape de lavage.
5. Retirez le tampon de lavage restant de l’aiguille de distribution à l’aide d’une micropipette. Ajouter 100 μL du substrat fluorogène (voir le tableau des matériaux). Faire couler le substrat fluorogène pendant 6 min à 50 μL/h.
6. Réglez les paramètres de mesure du débit (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h et 10 μL/h) et du temps (6 min) dans les onglets Débit et Réglage de la minuterie correspondants de l’interface qui contrôlent la pompe à seringue. Assurez-vous de sélectionner le mode Retrait pour chacune des mesures à effectuer.
7. Réglez une languette de débit supplémentaire à 50 μL/h et réglez la minuterie à 3 min pour l’étape de lavage.
8. Allumez la fluorescence du microscope 15 s avant que le substrat à 50 μL/h ne s’arrête. Démarrez la capture d’image avec le logiciel de la caméra du microscope 10 s avant que le substrat ne s’arrête avec un temps d’exposition de 1 000 millisecondes. Effectuez l’imagerie pendant 6 min à 1 image/s (FPS).
9. Cliquez sur le bouton Démarrer du paramètre de débit souhaité immédiatement après l’arrêt du débit de lavage du substrat à 50 μL/h. Cliquez sur le bouton Démarrer du débit de lavage (50 μL/h) immédiatement après l’arrêt du débit de mesure sélectionné.
10. Arrêtez la capture d’image et désactivez la fluorescence du microscope pour éviter le photoblanchiment du substrat.
11. Répéter les étapes 5.8 à 5.10 pour chaque mesure de débit utilisée.

Figure 1 : configuration finale de l’appareil. (A) Dispositif en acrylique avec les tuyaux fixés aux entrées et sorties correspondantes. L’échelle indique les dimensions de l’appareil en centimètres. (B) Protocole pour la formation du piège à microparticules. Les microparticules s’écoulent par gravité dans le canal lorsque l’appareil est placé en position verticale. Les microparticules sont concentrées à la restriction de 5 μm. Les microparticules en excès sont facilement éliminées en faisant pivoter la puce à travers le canal latéral. La puce est maintenue verticale pour préserver le piège avant l’immunodosage. (C) Dispositif microfluidique monté sur une lame de verre contenant l’aimant, sur la platine du microscope à fluorescence inversée. L’aiguille de distribution à travers laquelle les réactifs sont ajoutés est observée, ainsi que les tuyaux de sortie qui se connectent à une pompe à seringue.

Figure 2 : Séparation des nanoparticules. À l’aide d’un séparateur magnétique commercial, les nanoparticules de 100 nm peuvent être facilement concentrées pour effectuer les étapes de lavage pendant l’immunoessai. La pastille formée au bout de 15 min est observée dans le cercle rouge.