Méthode basée sur l’immunofluorescence pour quantifier le stress de réplication dans les cellules cancéreuses

Abstract

Source : Ramakrishnan, N. et al., Quantification du stress de réplication dans les cellules cancéreuses de l’ovaire à l’aide de l’immunofluorescence d’ADN simple brin.J. Vis. Exp. (2023)

La vidéo présente une approche basée sur l’immunofluorescence pour quantifier le stress de réplication dans les cellules cancéreuses. Les cellules traitées à l’hydroxyurée produisent de l’ADN simple brin, détecté par immunofluorescence. Le nombre de foyers de fluorescence verts indique le niveau de stress de réplication dans les cellules cancéreuses.

Protocol

REMARQUE : La lignée cellulaire du cancer de l’ovaire, OVCAR3, a été utilisée dans ces étapes, mais ce protocole est largement applicable à de multiples autres lignées cellulaires, y compris celles dérivées de sources non ovariennes. Un schéma du protocole est illustré à la figure 1.

1. Placage des cellules

1. Fabriquer des lamelles enrobées de poly-L-lysine.
   1. Ajouter des lamelles de recouvrement autoclavées de 12 mm de diamètre dans un tube conique de 50 mL avec une solution de poly-L-lysine et placer sur une bascule pendant 15 min.
   2. Aspirez la solution dans une hotte de culture tissulaire. Lavez les lamelles en ajoutant de l’eau stérile et remettez le tube contenant les lamelles sur la bascule pendant 5 min. Répétez cette étape de lavage trois fois.
   3. Étalez les lamelles enrobées sur un plat stérile et aspirez l’eau restante. Laissez sécher les lamelles dans le capot de culture tissulaire pendant 1 h ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gouttelettes d’eau. Une fois sec, fermez le plat avec du parafilm et placez-le à 4 °C.
2. Placez une lamelle recouverte de poly-L-lysine dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. L’utilisation de lamelles en polylysine est essentielle pour éviter le détachement des cellules des lamelles lors de l’étape de pré-extraction.
3. Trypsinisez les cellules OVCAR3 une fois qu’elles atteignent 70 % à 80 % de confluence.
   1. Pour essayer de pulvériser une boîte de culture de 10 cm qui est confluente à 70 % à 80 %, aspirez le milieu de la plaque et lavez-la avec 5 à 7 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   2. Aspirez le PBS, ajoutez 1 ml de trypsine à 0,25 % et placez le plat dans un incubateur à 37 °C pendant 8 à 10 minutes, ou jusqu’à ce que les cellules se détachent du bas de la plaque.
   3. Prélever les cellules avec 5 à 10 ml de milieu et les ajouter dans un tube conique.
   4. Comptez les cellules manuellement à l’aide d’un hémocytomètre à l’aide de procédures standard.
4. Faites une dilution de 25 000 cellules/mL et ajoutez 1 mL de cellules sur des lamelles de poly-L-lysine placées dans les puits des plaques de 24 puits. Pour toute autre lignée cellulaire, déterminez un nombre tel que les cellules soient confluentes d’environ 70 à 80 % après trois doublements de population.
5. Cultivez les cellules dans le milieu de culture dans des conditions standard.

2. Cellules pulsées avec IdU

1. Pour que les cellules se propagent correctement sur les lamelles, un doublement de la population suffit. Après un doublement de population, pulsez les cellules avec 10 μM de 5-iodo-2'-désoxyuridine (IdU) (voir le Tableau des matériaux sur la façon de reconstituer l'IdU) pour les deux doublements de population suivants.
   note: Nous avons essayé différents analogues de la thymidine, notamment la bromodéoxyuridine (BrdU), la 5-chloro-2′-désoxyuridine (CIdU) et l’IdU. Parmi les trois analogues, l’IdU donne le meilleur rapport signal/bruit. La figure 2 montre des images comparatives de cellules pulsées avec les trois analogues différents. Nous recommandons l’utilisation de deux témoins négatifs : (i) un échantillon pulsé sans IdU, et (ii) un témoin sans anticorps primaires. Si la formation d’ADNsb doit être évaluée en raison d’un traitement donné, nous recommandons d’ajouter le médicament après le premier tour de doublement de l’IdU.
2. Après avoir pulsé avec IdU pendant deux doublements de population, récoltez les cellules pour l’imagerie.
   1. Remplacer le milieu par du PBSTx 0,5 % froid (PBS + 0,5 % Triton X-100) sur de la glace pendant 5 min. Cette étape de pré-extraction aide à libérer les protéines cytoplasmiques et non liées à la chromatine, laissant intactes les protéines liées à la chromatine. Certaines lignées cellulaires peuvent facilement se décoller lors de la pré-extraction. Dans un tel scénario, on peut utiliser un tampon CSK à 0,5 % (10 mM de PIPES (pH 6,8),100 mM de chlorure de sodium (NaCl), 300 mM de saccharose, 3 mM de chlorure de magnésium (MgCl₂), 1 mM d’acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA) et 0,5 % de Triton X-100).

3. Fixation

1. Aspirez le PBSTx et incubez pendant 15 min avec 3 % de paraformaldéhyde (PFA) (Table des matériaux) à température ambiante, suivi de trois à quatre lavages avec 1x PBS. Les cellules fixes peuvent être maintenues à 4 °C jusqu’à ce que d’autres étapes se produisent.
   ATTENTION : Le PFA est hautement toxique et cancérigène. Évitez tout contact avec la peau, les yeux et les muqueuses. Effectuez toutes les étapes avec du PFA dans une hotte et éliminez les matériaux correctement.

4. Perméabilisation et blocage

1. Après la fixation, perméabiliser les cellules à l’aide de 0,5 % de PBSTx sur de la glace pendant 5 min. Utilisez un volume suffisant pour couvrir toute la lamelle (généralement entre 500 μL et 1 mL).
2. Lavez les cellules trois à quatre fois avec 0,2 % de PBST (1X PBS + 0,2 % de Tween-20) à température ambiante. Un mL de PBST suffit pour laver chaque puits. Effectuez les lavages l’un après l’autre sans aucune incubation.
3. Aspirer le PBST et bloquer les échantillons à l’aide de 5 % d’albumine sérique bovine, BSA (Table of Materials) réalisée dans 1x PBS (tampon bloquant) pendant 30 min à température ambiante.

5. Immunomarquage avec l’anticorps IdU

1. Pour l’immunocoloration, préparez une chambre humidifiée (essuie-tout humide sur un Tupperware à fond plat). Couvrez le couvercle de la plaque à 24 puits avec du parafilm, placez-le dans la chambre humidifiée et posez les lamelles sur le couvercle de la plaque.
2. Préparez l’anticorps primaire anti-BrdU de souris (Tableau des matériaux) en le diluant 1:200 dans le tampon de blocage à partir de l’étape 4.2. Il a déjà été démontré que l’anticorps anti-BrdU détecte l’IdU.
3. Ajouter 60 μL de dilution d’anticorps IdU sur le dessus des lamelles. Incuber les lamelles pendant 1 h à 37 °C.
   1. Alternativement, utilisez moins de solution d’anticorps si les lamelles sont retournées sur une goutte (20-25 μL) de dilution d’anticorps 1:200 pipetée sur du parafilm. Cela diminue également la probabilité que la solution se dessèche pendant l’incubation.
4. Après 1 h d’incubation, aspirez l’anticorps primaire. Remettez les lamelles dans une plaque à 24 puits et lavez-les quatre fois avec 0,2 % de PBST.
5. Pour l’anticorps secondaire, utilisez la même chambre humidifiée que celle décrite à l’étape 5.1. Diluer l’anticorps secondaire conjugué anti-souris (tableau des matériaux) dans le tampon de blocage (1:200). Ajoutez 60 μL d’anticorps secondaires dans les lamelles et incubez à température ambiante dans l’obscurité pendant 1 h. Cet anticorps secondaire est sensible à la lumière.
6. Aspirez l’anticorps secondaire. Remettez les lamelles dans la plaque à 24 puits et lavez-les quatre fois avec 0,2 % de PBST.
7. Étiquetez les lames de microscope et montez les lamelles sur les lames avec un support de montage 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (Table des matériaux). Conservez les lames dans l’obscurité à température ambiante pendant 24 h. L’incubation de 24 h est recommandée si le milieu de montage doit être durci ou durci.
   note: Les lames peuvent ensuite être stockées à 4 °C avant d’être imagées sur un microscope à fluorescence. Une image représentative est présentée à la figure 3.

Results

Figure 1 : schéma d’étiquetage IdU.Les cellules sont pulsées avec IdU pour deux doublements de population. Si un traitement médicamenteux est nécessaire, il doit être administré après le premier doublement de la population en présence d’IdU.

Figur...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 % de paraformaldéhyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g de saccharose + 100 mL 10X PBS + eau pour porter le volume à 925 mL. Ajouter 75 ml de PFA sans méthanol à 40 %, mélanger et faire des aliquotes de 50 mL avant l’entreposage Conservation : Conserver à -20 °C
5-iodo-2'-désoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 g/mol. Pour une matrice de 10 mM : dissoudre 3,541 mg d’IdU dans 1 mL d’ammoniac liquide 1 N
Anticorps anti-BrdU	BD Biosciences	Référence 347580	Conservation : Conserver à 4 °C
Anticorps secondaire anti-souris Alexa Fluor Plus 488	Thermo Scientific	Référence A32766	Sensible à la lumière - garder dans l’obscurité
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Réalisé en ajoutant une masse spécifique au volume de PBS Conservation : Conserver à 4 °C
Verre de couverture circulaire	Sciences de la microscopie électronique	Référence 72230-01
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Milieu de croissance : IPRP complété par de la L-glutamine, 0,01 mg/mL d’insuline bovine ; sérum fœtal bovin jusqu’à une concentration finale de 20 % et 1X Pen Strep Stockage : Milieu de congélation : milieu de croissance + 5 % de DMSO et stocké à -80 °C
Solution de poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Conservation : Conserver à 4 °C
Fixateur anti-effacement diamant ProLong avec DAPI	Thermo Scientific	Réf. P36962	Conservation : Conserver à 4 °C
Trypsine-EDTA, 0,25 %	Genesee Scientific	25 à 510	Conservation : Conserver à 4 °C
Eau filtrée stérile	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Conservation : Conserver à 4 °C