Une technologie Snap Chip pour un dosage immunologique sandwich multiplexé sans réactivité croisée

Résumé

Source : Li, H. et al., Snap Chip for Cross-reactivity-free-aren’s and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays.J. Vis. Exp. (2017)

La vidéo présente la mise en œuvre de la technologie Snap Chip pour les immunoessais sandwich multiplexés sans réactivité croisée. Le simple fait de casser deux lames de microréseaux, chacune contenant des réactifs différents, garantit le transfert de réactifs sans contamination croisée et permet de détecter plusieurs protéines à l’aide d’un dosage immunologique sandwich.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Fabrication et stockage des puces Snap

1. Méthode de transfert unique (Figure 1a)
   1. Des solutions ponctuelles de cAb contenant 400 μg/mL d’anticorps et 20 % de glycérol dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur une lame de dosage de nitrocellulose (ou de verre fonctionnalisé) avec un détacheur de microréseau à jet d’encre à une humidité relative de 60 % (1,2 nL pour chaque point) avec un espacement de centre à centre de 800 μm. Assurez-vous que la glissière est fixée sur le pont de repérage selon un coin (ici, le coin inférieur gauche a été utilisé).
   2. Incuber la lame de test tachetée à température ambiante pendant 1 h avec une humidité relative de 60 %.
   3. Fixez un joint de module de glissière à 16 compartiments sur la lame de test pour la diviser en 16 puits. Rincez la lame trois fois en ajoutant 80 μL de PBS contenant 0,1 % de Tween-20 (PBST) dans chaque puits, et en secouant à 450 tr/min sur un agitateur, 5 min à chaque fois.
   4. Ajouter 80 μL de solutions de blocage dans chaque puits et agiter pendant 1 h à 450 tr/min.
   5. Retirez le joint et séchez la lame de dosage avec un jet d’azote.
   6. Fixez une glissière de transfert sur le plateau de repérage et poussez le coin inférieur gauche du curseur contre le coin inférieur gauche du plateau de repérage. Le jet d’encre repère un ensemble de marques d’alignement (une solution de microbilles de polystyrène) avec la même disposition que celle des anticorps de capture (cAbs).
   7. Laissez sécher les marques d’alignement. Retournez la glissière de transfert et remettez-la sur le pont de repérage, en la fixant contre le coin inférieur gauche.
   8. Préparez les solutions de repérage d’anticorps de détection (dAb) contenant 20 μg/mL d’anticorps, 20 % de glycérol et 1 % d’albumine sérique bovine (BSA).
   9. À l'aide de l'appareil photo de l'observateur, prenez une photo d'un repère d'alignement. Implémentez cette image dans le programme de repérage en tant que repère et obtenez le système de reconnaissance d’image du repéreur à jet d’encre pour identifier la marque en haut à gauche. Utilisez sa coordonnée comme premier point du réseau dAb. Spot 8 nL par gouttelette avec un espacement de centre à centre de 800 μm.
2. Méthode de transfert double (figure 1b)
   1. Placez une diapositive de transfert 1 sur la platine de repérage à jet d’encre contre le coin inférieur gauche. Placez des solutions de cAbs contenant 400 μg/mL d’anticorps, 20 % de glycérol et 1 % de BSA dans du PBS sur la lame à l’aide d’un détecteur de microréseaux à jet d’encre à une humidité relative de 60 % (0,4 nL pour chaque point et d’un diamètre de ~ 200 μm). L’espacement centre à centre est de 400 μm.
   2. Enclenchez la lame de transfert à l’aide d’une lame d’essai recouverte de nitrocellulose (ou d’une lame en verre fonctionnalisé) à l’aide d’un appareil à enclenchement (Figure 2) pour transférer les gouttelettes de cAb sur la lame d’analyse.
      1. Tournez les six boutons sur le côté de l’appareil d’enclenchement de 90 degrés pour tirer et verrouiller tous les pistons en position ouverte. Insérez la glissière de transfert dans le support de diapositive de son réceptacle avec le coin clipsé face à la goupille pogo fixe. Tournez le premier ensemble de trois boutons pour libérer les pistons avec la goupille pogo dorée et assurez-vous que les glissières sont poussées contre les goupilles d’alignement.
      2. Insérez une lame recouverte de nitrocellulose dans l’appareil à pression à l’envers, assise sur les 4 broches pogo. Tournez le deuxième ensemble de trois boutons pour libérer les pistons avec la goupille argentée et assurez-vous que les glissières sont poussées contre les goupilles d’alignement.
      3. Fermez l’appareil à pression en plaçant la coque supérieure sur le support de glissière à l’aide des piliers d’alignement et des trous pour un positionnement précis.
      4. Insérez l’appareil à pression fermé dans sa cage et poussez complètement la languette de fermeture vers le bas pour amener les microréseaux face à face tout en appliquant la pression appropriée. Garder fermé pendant 1 min.
   3. Séparez les diapositives. Incuber la lame de dosage à température ambiante pendant 1 h avec une humidité relative de 60 %. Lavez, bloquez et séchez la lame de test comme décrit aux étapes 1.1.3 à 1.1.5.
   4. Placez une autre diapositive de transfert sur le plateau de repérage à jet d’encre et poussez-la contre le coin inférieur gauche. Solutions ponctuelles de dAb contenant 50 ou 100 μg/mL d’anticorps (voir le tableau 1), 20 % de glycérol et 1 % de BSA dans du PBS. Assurez-vous que chaque point est de 0,8 nL et que l’espacement entre les points est de 400 μm.
   5. Stockez le test et la lame de transfert. Scellez les lames de test et de transfert dans un sac hermétique contenant un déshydratant et placez-les dans un congélateur à -20 °C.

2. Immunodosages multiplexés avec puces instantanées

1. Récupérez la lame de test du congélateur. Laissez le sac scellé pendant 30 minutes jusqu’à ce que la lame revienne à température ambiante.
2. Préparez des solutions d’échantillons dilués en série en 7 points en dotant des protéines dans du PBS contenant 0,05 % de Tween-20.
   note: Ici, un facteur de dilution de 5 fois est utilisé. Les concentrations initiales de chaque protéine sont indiquées dans le tableau 1.
3. Préparez des exemples de solutions au besoin. Par exemple, diluez le sérum humain 4 fois dans un tampon PBST.
4. Fixez un joint à 16 compartiments sur la lame de dosage.
5. Remplissez une colonne de 8 puits avec les 7 solutions de dilution des protéines et une solution tampon PBST sans protéines par pipetage. Pipeter les solutions d’échantillon dans les 8 autres puits sur la même lame.
   REMARQUE : Des solutions de 80 μL peuvent être insérées dans chaque puits. D’autres lames peuvent être utilisées pour mesurer des échantillons supplémentaires si nécessaire.
6. Incuber les échantillons sur un agitateur à 450 tr/min soit pendant 1 h à température ambiante, soit une nuit à 4 °C. Laver la lame trois fois avec du PBST sur l’agitateur à 450 tr/min, 5 min à chaque fois. Retirez le joint et séchez la lame sous un jet d’azote gazeux.
7. Récupérez la lame de transfert avec les dAbs du congélateur. Gardez le sac fermé pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, incubez la lame dans une chambre fermée (par exemple une boîte d’embouts vides) contenant 60 % de billes de stabilisation de l’humidité pendant 20 min pour la réhydratation.
8. Enclenchez la lame de transfert avec la lame de dosage à l’aide d’un appareil à enclenchement (Figure 2) pour transférer les gouttelettes de dAb. Voir la section 1.2.2 pour le fonctionnement de l’appareil à enclenchement.
9. Séparez les diapositives. Incuber la lame de test dans une chambre fermée contenant 60 % de billes de stabilisation de l’humidité pendant 1 h. Clampez la lame de dosage à l’aide d’un joint à 16 compartiments et rincez la lame 4 fois à l’aide d’un PBST sur un agitateur à 450 tr/min, 5 min à chaque fois.
10. Pipeter 80 μL de solutions contenant 2,5 μg/mL de fluorophore de streptavidine dans du PBS dans chaque puits. Incuber pendant 20 min sur un agitateur à 450 tr/min.
11. Rincez la lame 3 fois avec du PBST et une fois avec de l’eau distillée sur le shaker à 450 tr/min. Retirez le joint et séchez la lame à l’aide d’azote gazeux.

3. Numérisation des lames et analyse des données

1. Numérisez la lame de test à l’aide d’un scanner à microréseau à fluorescence à l’aide du laser 635 nm.
2. Extrayez l’intensité nette de chaque spot à l’aide d’un logiciel d’analyse (ex : analyseur array-pro).
3. Calculez la limite de détection (LOD) de chaque protéine à l’aide d’un logiciel de statistiques et déterminez les concentrations de protéines dans les échantillons.
   note: La LD est définie comme l’ordonnée à l’origine de la courbe standard incrémentée de trois fois l’écart-type de trois tests indépendants.

Tableau 1. Concentrations en protéines et LD dans le tampon du test 50-plex. La LD pour CA 15-3 est exprimée en U/ml (*).

Nom de la protéine	Concentration de départ (ng/ml)	Niveau de détection (pg/ml)	Nom de la protéine	Concentration de départ (ng/ml)	Niveau de détection (pg/ml)
ANG2	500	1,3 × 104	IL-6b	1	2,1 × 102
Le BDNF	500	1,0 × 102	IL-5	50	77
CA 15-3*	1	4,9 × 103	L’IL-4	1000	1,5 × 104
Cea	1000	5,4 × 103	L’IL-2	50	76
CXCL10/IP-10	50	1,7 × 102	LEP	200	4,0 × 102
Crp	200	44	Mig	500	11 × 102
Eng	1000	6,2 × 102	CCL3/MIP-1α	50	3.3
FEM	50	1,8 × 102	CCL4/MIP-1β	50	12
EGFR	200	1,9 × 102	MMP-3	500	1,0 × 102
SAF-L	500	4,5 × 102	M-CSF	500	8,2 × 103
FGF	500	1,0 × 103	MMP-9	200	3,1 × 102
G-CSF	500	39	CCL2/MCP-1	50	55
GM-CSF	50	3.8	NCAM-1	500	1,7 × 103
GRO-α	50	3,0 × 102	β-NGF	200	1,4 × 103
HER2	500	3,5 × 103	NT-3	200	5,8 × 102
PDGF-BB	200	73	OPN	500	1,9 × 103
IL-1β	500	7,9 × 102	RBP4	200	1,2 ×102
L’IL-1ra	200	1,1 × 103	Sparc	1000	4,6 ×104
L’IL-15	50	8,2 × 102	TNF-α	50	4.4
L’IL-12	1	30	TNF-RI	50	1.3 × 102
L’IL-11	500	1,2 × 103	TNF-RII	50	12
L’IL-10	500	6,1 ×102	SAF/TNFRSF6	200	2,8 ×102
L’IL-8	50	6.6	L’uPA	200	24
L’IL-7	2.5	26	uPAR(CD87)	200	76
IL-6a	1000	84	Le VEGF	200	6,7 × 102

Résultats

Graphique 1. Schéma de la procédure de dosage comparant (a) les méthodes de transfert simple et (b) les méthodes de transfert double.

Graphique 2. Schéma montrant les différences entre le transfert simple et le transfert double.(a) La mis...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pastille saline tamponnée au phosphate	Fisher Scientific	Référence 5246501EA
Cy5 conjugué à la streptavidine	Rockland	S000-06
Préadolescent-20	Sigma-Aldrich	p. 1379
Albumine sérique bovine	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc	Référence 001-000-162
glycérol	Sigma-Aldrich	Référence G5516
Solution de blocage : stabilisateur de microarray StabilGuard Choice sans BSA	SurModics, Inc	CE 02
Lames revêtues de nitrocellulose	Grace Bio-Laboratories, Inc	305116
Lames revêtues d’aminosilane	Schott Amérique du Nord	1064875
Appareil Snap	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
Repéreur de microréseaux à jet d’encre	GeSiM	Nanotraceur 2.0
Joint de module coulissant	Grace Bio-Laboratories, Inc	204862
Perles de stabilisation de l’humidité	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Logiciel Array-Pro Analyzer	Cybernétique des médias	Version 4.5
Scanner à fluorescence	Agilent	Scanner de microréseaux SureScan
Logiciel de biostatistique	Logiciel GraphPad	GraphPad Prism 6
Anticorps anti-capture d’endogline	Systèmes de R&D	MAB10972
Protéine d’endogline	Systèmes de R&D	1097-FR
Anticorps de détection d’endogline	Systèmes de R&D	BAF1097
IL-6a (voir tableau 1)	Systèmes de R&D
IL-6b (voir tableau 1)	Invitrogen