Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Coloration avec le premier anticorps
- Déparaffinez et réhydratez des lames fixées au formol et incluses dans de la paraffine (FFPE) avec 5 minutes allouées à chacune des étapes suivantes : xylène ou réactifs équivalents 3x, 100 % éthanol 2x, 95 % éthanol 1x, 70 % éthanol 1x, 50 % éthanol 1x et eau distillée 2x.
note: Les lames doivent rester humides à partir de cette étape de réhydratation jusqu’au montage à l’étape finale.
- Pour le prélèvement facultatif de l’antigène, placez les lames dans 275 mL de solution bouillante de citrate de sodium (10 mM, pH = 6,0) pendant 8 min. Pour maintenir la solution à ébullition, placez les lames à plat au fond d’une boîte à pointes depipette de 14 x 9,5 x 9 cm 3 (L x L x H) avec un couvercle et passez la solution au micro-ondes à 70 % de puissance dans un four à micro-ondes de 700 W pendant 8 min. Retirez ensuite la boîte à pointes de pipette du four à micro-ondes, ouvrez le couvercle et laissez la solution refroidir à température ambiante (RT) pendant au moins 20 min.
- Transvaser les lames dans un bocal Coplin contenant du PBST (solution saline tamponnée au phosphate avec 0,1 % de polysorbate 20/80). Laver avec PBST pendant 5 min 3x. Si vous ne passez pas immédiatement à l’étape suivante, conservez les lames à cette étape avec PBST dans un bocal Coplin à RT pendant quelques heures ou à 4 °C pendant 1 à 2 jours si vous ne passez pas immédiatement à l’étape suivante.
- Pour préparer la solution bloquante, utilisez le sérum normal de l'espèce hôte de l'anticorps secondaire comme réactif bloquant. D’autres réactifs de blocage commerciaux peuvent également être utilisés. Si vous utilisez du sérum normal utilisé pour l’étude présentée dans cette étude, ajoutez 100 μL de sérum d’âne normal à 4,9 ml de PBST. La solution de blocage peut être conservée à 4 °C jusqu’à 3 jours.
- Pour le blocage, secouez le PBST des lames et couvrez-les rapidement avec une solution de blocage suffisante. Incuber les lames à RT dans une chambre humidifiée pendant 30 min.
- Préparez la solution d’anticorps primaires (500 μL pour deux lames) en utilisant la solution bloquante pour diluer l’anticorps primaire à la concentration souhaitée. La solution doit être conservée sur de la glace jusqu’à son utilisation.
- Pour la 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase (3βHSD), ajoutez 2 μL d’anticorps 3βHSD dans 498 μL de solution bloquante.
- Pour la tyrosine hydroxylase (TH), ajoutez 0,5 μL d’anticorps TH dans 499 μL de solution bloquante.
- Pour la β-caténine, ajoutez 1 μL d’anticorps β-caténine dans 499 μL de solution bloquante.
- Pour la 20α-hydroxystéroïde déshydrogénase (20αHSD), ajoutez 1 μL d’anticorps 20αHSD dans 499 μL de solution bloquante.
- Pour le cytochrome P450 2F2 (CYP2F2), ajoutez 2 μL d’anticorps CYP2F2 dans 498 μL de solution bloquante.
- Incuber avec l’anticorps primaire en secouant la solution bloquante des lames et en les recouvrant rapidement d’une solution d’anticorps primaire suffisante. Incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant la nuit à 4 °C. Pendant l’incubation, les lames peuvent être recouvertes d’un petit morceau de film de paraffine pour éviter le dessèchement.
- Le lendemain matin, lavez les lames avec du PBST pendant 5 minutes 3x.
- Préparez la solution d’anticorps secondaires (500 μL pour deux lames) en utilisant la solution bloquante pour diluer l’anticorps secondaire biotinylé à la concentration souhaitée (p. ex., 1 μL d’anticorps anti-souris d’âne ou d’anticorps anti-lapin d’âne dans 499 μL de solution bloquante). La solution doit être conservée sur de la glace jusqu’à son utilisation.
- Incuber avec le deuxième anticorps en secouant le PBST des lames et en les recouvrant rapidement d’une solution d’anticorps secondaire suffisante. Incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant 1 h à RT.
note: Si la biotine endogène est préoccupante, utilisez un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase au lieu de l’anticorps secondaire biotinylé. Passez à l’étape 1.14 si vous utilisez un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase à l’étape 1.10.
- Lavez les lames avec du PBST pendant 5 min 3x.
- Préparez la solution de streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (SA-HRP) (500 μL pour deux lames) en ajoutant 0,5 μL de SA-HRP dans 499 μL de PBS. La concentration finale est de 1 μg/mL.
- Incuber avec la solution SA-HRP. Séparez le PBST des lames et recouvrez rapidement les lames avec une solution SA-HRP suffisante. Incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant 0,5 h à RT.
- Lavez les lames avec du PBST pendant 5 min 3x.
- Préparez la solution de fluorophore-tyramide en diluant le fluorophore-tyramide avec son tampon de dilution selon les instructions du fabricant (p. ex., 5 μL de fluorophore-tyramide dans 496 μL de tampon de dilution).
- Effectuez le développement du signal avec du fluorophore-tyramide en secouant le PBST des lames et en recouvrant rapidement les lames avec une solution de fluorophore-tyramide suffisante. Incuber dans une chambre humidifiée pendant 1 min à RT. Le temps d’incubation peut être ajusté pour obtenir l’intensité de fluorescence souhaitée. Arrêtez la réaction en transférant les lames dans un bocal Coplin contenant du PBST. Laver les lames avec du PBST pendant 3 min 2x.
- Les signaux peuvent être rapidement vérifiés au microscope à fluorescence pour confirmer le résultat à ce stade. Si vous n’utilisez pas de lamelles, appliquez une goutte de glycérol :PBS (1:1) sur chaque section pour garder les échantillons humides. Laver les lames avec du PBST pendant 3 min 2x. Les lames peuvent être stockées dans du PBST à 4 °C pendant quelques jours avant de passer à l’étape suivante.
2. Éliminer le premier anticorps
- Placez les lames dans 275 mL de solution bouillante de citrate de sodium (10 mM, pH = 6,0) pendant au moins 8 min. Maintenez la solution bouillante en plaçant les lames à plat sur le fond d’une boîte à pointes de pipette de 14 x 9,5 x 9 cm3 (L x L x H) avec un couvercle et en passant la solution au micro-ondes à 70 % de puissance dans un four à micro-ondes de 700 W pendant 8 min. Si un temps de décapage plus long est préféré, il peut être nécessaire de compléter le tampon à l’aide d’une solution bouillante de citrate de sodium pour maintenir les lames immergées dans la solution tampon à tout moment. Retirez la boîte à pointes de pipette du four à micro-ondes, ouvrez le couvercle et laissez la solution refroidir à RT pendant au moins 20 min.
- Transférez les lames dans un bocal Coplin contenant du PBST. Laver avec PBST pendant 5 min 3x. Si l’étape suivante n’est pas effectuée immédiatement, conservez les lames dans un bocal Coplin avec PBST à RT pendant quelques heures ou à 4 °C pendant 1 à 2 jours.
3. Coloration avec le deuxième anticorps
- Commencez par l’étape de blocage et suivez les mêmes procédures de l’étape 1.5 à l’étape 1.14. Aux étapes de développement du signal (étape 1.15 et étape 1.16), utilisez le fluorophore-tyramide dans un spectre de fluorescence différent.
note: Les lames peuvent être décappées à l’aide de cette méthode plusieurs fois pour permettre une coloration multiplexe. Le dernier anticorps n’a pas besoin de fluorophore-tyramide comme rapporteur. Un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore peut être utilisé pour montrer les signaux du dernier anticorps primaire.
- Incuber les lames avec 2 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou une solution de Hoechst pendant 1 min à RT si une contre-coloration nucléaire est nécessaire. Ensuite, lavez les lames avec du PBST pendant 3 min 2x.
