Imagerie par immunofluorescence multiplexée pour analyser les sous-populations de lymphocytes T résistants à l’immunothérapie

Résumé

Source : Granier, C., et al. Analyse par immunofluorescence multiplexée et quantification des lymphocytes T intratumoraux-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente une technique d’imagerie multispectrale de fluorescence in situ pour analyser différentes sous-populations de lymphocytes T infiltrants dans le tissu tumoral. La cryosection tissulaire d’un carcinome rénal est traitée à l’aide d’anticorps afin de marquer les lymphocytes T CD8+ qui expriment des récepteurs inhibiteurs spécifiques et présentent un phénotype résistant à l’immunothérapie. La coupe marquée est visualisée à l’aide d’un microscope multispectral afin d’identifier les sous-populations distinctes de lymphocytes T CD8+.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut

1. Coloration par immunofluorescence in situ des lymphocytes infiltrant la tumeur (TILs)

1. Lignes directrices procédurales
   1. Effectuez toutes les étapes expérimentales à température ambiante.
   2. Pour toutes les étapes, effectuez les dilutions avec Tris Buffer Saline (TBS ; voir Tableau des matériaux).
   3. Effectuez le lavage dans le TBS pour toutes les étapes sauf après l’incubation primaire de l’anticorps. Pour ce dernier, utilisez Tris Buffer Saline Tween20 (TBST, voir Tableau des matériaux). Pour la composition et la reconstitution du tampon, voir le tableau 1.
   4. Utilisez une chambre d’humidité pour l’incubation d’anticorps et un bocal de coloration pour le lavage.
   5. Ne laissez pas la section se dessécher pendant la procédure.
2. prétraitement
   1. Décongelez la lame contenant l’échantillon de tissu et séchez soigneusement la lame autour de l’échantillon avec une serviette en papier. Délimitez la zone réactionnelle contenant le tissu à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe (voir tableau des matériaux). Sécher pendant 2 min.
   2. Fixez les échantillons à 100 % d’acétone pendant 5 min, séchez-les pendant 2 min et lavez-les avec du TBS pendant 10 min.
3. Saturation et blocus
   1. Prétraitez les lames pendant 10 minutes avec 3 gouttes d’avidine 0,1 %, tapotez et/ou effleurez la lame pour répartir l’avidine et éliminer les bulles d’air, puis traitez pendant 10 minutes avec 3 gouttes de biotine 0,01 % (voir le tableau des matériaux), tapotez et/ou effleurez. Laver avec du TBS.
   2. Effectuez un blocage des récepteurs Fc. Appliquer 100 μL d’un volume/volume de 5 % de sérum normal dilué dans du TBS. Utiliser du sérum de la même espèce hôte que l’anticorps secondaire ou tertiaire étiqueté (voir le tableau des matières) ; Le sérum d’âne a été utilisé ici. Incuber pendant 30 min.
   3. Pendant l’incubation, faites tourner brièvement les anticorps anti-CD8, protéine de mort cellulaire programmée 1 (-1), immunoglobuline des lymphocytes T et protéine 3 contenant de la mucine (Tim-3) (Table des matériaux). Préparer le mélange d’anticorps primaires dans le TBS comme décrit dans le tableau 2.
4. Immuno-coloration pour CD8,-1 et Tim-3
   1. Préparez le mélange d’anticorps primaires. Voir le Tableau des matières et le Tableau 2 pour connaître les anticorps utilisés (anti-CD8,-1, Tim-3 et leurs anticorps secondaires correspondants) et leurs concentrations.
   2. Tapotez et/ou effleurez le sérum d’âne restant (ajouté à l’étape 1.3.2). Incuber les lames avec 100 μL du mélange d’anticorps primaires non marqués pendant 1 h dans une chambre humidifiée.
   3. Pendant l’incubation, faites tourner brièvement les anticorps anti-lapin Cyanine 5, Alexa Fluor 488-anti-chèvre et anti-souris biotinylés et préparez le mélange d’anticorps secondaires comme décrit dans le tableau 2.
   4. Lavez les lames dans TBST pendant 5 min. Séchez les lames.
   5. Incuber les lames avec 100 μL d’anticorps secondaires pendant 30 min dans une chambre humidifiée.
   6. Préparez le mélange d’anticorps tertiaires contenant de la cyanine 3-streptavidine, comme décrit dans le tableau 2.
   7. Lavez les lames dans du TBS pendant 10 min. Séchez les lames.
   8. Incuber les lames avec 100 μL du mélange d’anticorps tertiaires pendant 30 min.
   9. Lavez les lames dans du TBS pendant 10 min. Séchez les lames.
5. Montage sur cellule
   1. Montez les lames dans un milieu de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI) (1,5 μg/mL DAPI) avec une lamelle compatible avec la microscopie à fluorescence (voir le tableau des matériaux).
      note: Comme contrôle négatif pour chaque expérience, une lame avec des anticorps isotypiques a été utilisée à la même concentration que les anticorps correspondants. Pour cette coloration, nous avons utilisé des anticorps IgG1 de souris, IgG de lapin et IgG négatifs de chèvre (voir le tableau des matériaux). Comme contrôle positif, nous avons utilisé l’amygdale hyperplasique humaine, qui est connue pour être positive pour les marqueurs testés, pour chaque expérience. Une coloration typique est décrite dans les résultats (Figure 1). La monocoloration de CD8,-1 et Tim-3 doit être effectuée individuellement (une coloration par lame) avec le même prétraitement et sans DAPI. Une lame dans les mêmes conditions expérimentales sans aucun anticorps et uniquement avec un support de montage DAPI doit également être réalisée. Une lame doit être imagée dans des conditions expérimentales identiques, sans anticorps et sans DAPI.

2. Analyse de fluorescence et comptage automatisé des cellules

1. Acquisition d’images avec le microscope automatisé
   1. Créez un protocole.
      1. Allumez le logiciel du microscope automatisé et l’illuminateur de fluorescence.
      2. Dans la barre de menu, cliquez sur « Fichier », « Créer un protocole », sélectionnez « DAPI », « FITC » et « TRITC ».
      3. Cliquez sur « Suivant », « Coupe de tissus », puis sur « Suivant », « Nom du protocole ». Choisissez un nom, par exemple, « CD8--1-Tim-3 », cliquez sur « Suivant » et « Enregistrer ».
      4. Placez manuellement une diapositive sur la scène.
      5. Dans la barre de menus, cliquez sur « configuration » et sur « paramètres ». Cliquez sur « Définir l’accueil Z » dans la nouvelle fenêtre.
      6. Ajustez le temps d’exposition à l’aide d’une lame de contrôle positif, c’est-à-dire un CD8, un-1 et un Tim-3 triplement colorés avec un échantillon DAPI.
      7. Dans la barre de contrôle, cliquez sur « régler l’exposition ».
      8. Ajustez le temps d’exposition de chaque filtre jusqu’à l’obtention d’un signal suffisant mais non saturant.
      9. Pour l’imagerie monochrome, procédez comme suit :
      10. Sélectionnez l'acquisition, puis sous « autofocus », choisissez le filtre DAPI.
      11. Dans la « limite de la zone de balayage », déplacez l’objectif en haut vers le coin supérieur gauche de la diapositive. Cliquez sur « Marquer ». Faites de même pour le coin inférieur droit.
          note: Cette étape délimite la zone d’imagerie basse consommation (imagerie LP) à 4X ; Assurez-vous de bien placer le repère pour entourer tous les échantillons de la série.
      12. Pour l’imagerie haute puissance (HP), effectuez les opérations suivantes :
      13. Sous « Autofocus », choisissez « DAPI ».
      14. Sous la bande « Acquisition », choisissez « DAPI », « FITC », « Cy3 » et « Cy5 ». Cliquez sur « OK ». Cliquez sur « Fichier » et « Enregistrer le protocole » dans la barre de menu.
   2. Scannez les diapositives.
      1. Chargez le protocole en cliquant sur « Fichier » et « Charger le protocole » dans la barre de menu. Cliquez sur « Démarrer ».
      2. Entrez « Lab ID » (emplacement du dossier pour le stockage des images). Entrez l’ID de la diapositive pour identifier la diapositive. Cliquez sur « Suivant ».
      3. Cliquez sur « Imagerie monochrome » (pour numériser l’ensemble de la diapositive sous une lumière de champ vif et acquérir des images séquentielles à l’aide d’un objectif 4x).
         note: Cela produit une vue d’ensemble en niveaux de gris de la diapositive.
      4. Cliquez sur « Trouver un échantillon ». Sélectionnez la zone de tissu à numériser à basse résolution (4x) : maintenez la touche « Ctrl » enfoncée et cliquez sur une trame à l'aide du curseur pour sélectionner ou désélectionner des trames (Figure 2A).
      5. Cliquez sur « LP Imaging » (imagerie 4x) pour l’acquisition d’images fluorescentes Rouge-Bleu-Vert de chaque champ.
      6. Pour la sélection de champs HP, maintenez la touche « Ctrl » enfoncée et cliquez sur un champ à l'aide du curseur pour sélectionner ou désélectionner les champs correspondant à la zone tissulaire qui sera numérisée à haute résolution (20x). Sélectionnez 5 champs (Figure 2B).
      7. Cliquez sur « HP Imaging » (imagerie 20x) pour une acquisition d’image multispectrale de chaque champ (Figure 2C).
      8. Cliquez sur « Data Storage » pour stocker les images dans le dossier sélectionné au début dans LabID.
         note: Le processus est résumé et illustré à la figure 2. Pour chaque étape (détection des tissus, sélection du terrain), un algorithme peut être incrémenté et entraîné par l’utilisateur pour un processus de numérisation entièrement automatisé.

Tableau 1 : Composition du tampon de TBS et TBST. Le TBS est utilisé pour les mélanges et les dilutions d’anticorps. Pour les lavages, toutes les étapes sont effectuées avec du TBS, à l’exception des lavages après les anticorps primaires, où le TBST est recommandé.

	Tbs	TBST
Tris-HCl	0,05 M	0,05 M
NaCl	0,15 M	0,15 M
Préadolescent 20	-	0,05 %
pH	7,6	7,6
préparation	1 comprimé en 500 mL H2O

Tableau 2 : Composition détaillée du mélange d’anticorps pour la coloration par immunofluorescence CD8--1-Tim-3. Pour chaque mélange d’anticorps primaires, secondaires et tertiaires, la dilution à effectuer dans le volume correspondant de TBS est donnée pour un volume total de 1 mL. Pour une lame, le volume total de réaction est de 100 μL pour une surface tissulaire de 2^cm2.

Le volume de l’anticorps primaire			Finale V = 1 mL
Lapin anti-CD8	Souris anti--1	Chèvre anti-Tim-3	Tbs
1,6 μL	2 μL	30 μL	966,4 μL
Le volume de l’anticorps secondaire
Cyan 5 anti-lapin	Anti-souris biotinylée	Alexa Fluor 488 anti-chèvre	Tbs
3,3 μL	2 μL	2,5 μL	992,2
Le volume d’anticorps tertiaires
	Streptavaridine marquée au Cy3		Tbs
	3,3 μL		996,7

Résultats

Figure 1 : Immunomarquage CD8--1-Tim-3 sur un tissu contenant de la paraffine amygdale. Des coupes de tissus enrobées de paraffine au lieu de coupes cryopréservées ont été sélectionnées pour une triple immunomarquage. Après le déparaffinage et la réhydratation, le même protocole de coloration précédemment développé pour les coupes cryoconservées a été appliqué. Les lymphocytes T CD8+ sont situ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vectra 3 Imagerie pathologique quantitative automatisée	Perkin Elmer	CLS142338
Analyse de cellules inForm 2.1.	Perkin Elmer	CLS135781
Logiciel R	https://www.r-project.org
Dakopen stylo de délimitation	Dako	S2002
Tris Buffer Saline TBS Pastilles	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH7,6 100 comprimé
Tris Buffer Saline Tween 20 TBS(+Tween20)	Takara, Bio Inc.	TAKT9142Z	pH 7,6 100 comprimés
Système de blocage de la biotine	Dako	X0590	Avidine 0,1 % et Biotine 0,01 %
Sérum d’âne normal	Jackson Immunorecherche	Référence 017-000-001	Concentration de 5 % vol./vol.
Fluoroshield avec DAPI	Sigma-aldrich	F6057	Concentration de 1,5 μg/mL
Lamelle en verre Knittel	Knittel Gläser,	100039	24x60 mm 100 lamelles de recouvrement
Lapin anti-CD8 Clone P17-V	Novus	NBP1-79055	utilisation à 4μg/mL
Souris anti--1 Clone NAT	ABCAM	AB52587	utilisation à 2 μg/mL
Chèvre anti-Tim-3	R&D	AF2365	utilisation à 3 μg/mL
Lapin anti--L1 Clone SP142	Roche	7309457001	utilisation à 1 μg/mL
Souris AF647 étiquetée pan- Clone de kératine C11	Signalisation cellulaire	4528	utilisation à 0,5 μg/mL
Chèvre anti-humain gal9	R&D	AF2045	utilisation à 0,3 μg/mL
Cyan 5 âne conjugué anti-lapin	Jackson Immunorecherche	Tél. : 711-175-152	utilisation à 5 μg/mL
IgG anti-souris d'âne F(ab'2) biotinylées	Jackson Immunorecherche	Tél. : 715-066-150	utilisation à 3 μg/mL
Alexa Fluor488 âne conjugué anti-chèvre IgG	ABCAM	AB150133	utilisation à 5 μg/mL
Streptavaridine marquée au Cy3	Amersham	PA43001	utilisation à 3 μg/mL
Souris témoin négative IgG1	Dako	X0931	utilisation à 2 μg/mL
IgG du sérum de chèvre	Sigma-aldrich	I5256	utilisation à 3 μg/mL
IgG du sérum de lapin	Sigma-aldrich	I5006	utilisation à 4μg/mL