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1. Ensemencement cellulaire et infection virale
- De 20 à 24 heures avant l'infection virale, ensemencez 5 x 104 cellules de fibroblastes du poumon embryonnaire humain (HEL) ou d'autres cellules à examiner sur une lame décalée à 4 puits de 11 mm dans un milieu de croissance (milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS)). Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
note: Chaque puits doit avoir une confluence cellulaire de 70 à 80 % au moment de l’infection.
- Le lendemain, retirez le milieu de croissance et infectez les cellules avec des virus dans le milieu 199 à une plage de 4 à 10 UFC/cellule. Incuber les cellules infectées par le virus pendant 1 h à 37 °C. Continuez à agiter la lame pendant la période d’incubation.
- Après 1 h d’incubation, retirer Medium-199 et compléter avec du milieu de croissance.
note: Des médicaments qui interfèrent avec les différentes phases de l’infection peuvent être ajoutés à cette étape ou avant l’absorption virale.
- Incuber les cellules infectées par le virus à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant différentes durées de période d’infection.
2. Fixation et perméabilisation
- Au bon moment de l’infection, laver rapidement les cellules infectées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 fois et ajouter 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % fraîchement préparé dans du PBS. Incuber les cellules avec du paraformaldéhyde pendant 8 à 10 minutes à température ambiante pour fixer les cellules dans chaque puits.
- Aspirez du paraformaldéhyde et lavez les puits avec 200 μL de PBS pendant 3 fois. Aspirez complètement PBS après le 3ème lavage.
- Ajoutez 100 μL de tensioactif non ionique à 0,2 % dans chaque puits pour perméabiliser les cellules pendant 5 à 10 min.
- Aspirez le tensioactif non ionique et lavez les puits avec 200 μL de PBS pendant 3 fois.
3. Coloration immunofluorescente
- Aspirer complètement le PBS et ajouter 200 μL de tampon de blocage (1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 5 % de sérum de cheval dans le PBS) dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4 °C pendant la nuit.
- Ajouter la concentration déterminée expérimentalement de l’anticorps primaire contre la protéine cellulaire infectée 0 (anticorps polyclonal anti-ICP0 de lapin) dans le tampon de blocage et incuber l’anticorps primaire à température ambiante pendant 2 h ou à 4 °C pendant la nuit.
- Laver avec un tampon de blocage 3 fois avec une incubation de 10 minutes. Ajoutez l’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre conjugué à Alexa 594 (1:400 dilué dans un tampon de blocage) et incubez les lames à température ambiante pendant 1 h. Ensuite, lavez les lames 3 fois avec un tampon de blocage à 10 minutes d’intervalle.
- Enfin, lavez la lame une fois avec du PBS pour éliminer les résidus de BSA et de sérum de cheval.
- Ajoutez une goutte de support de montage anti-décoloration avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour monter la lame et scellez-la avec une lamelle à l'aide d'un vernis à ongles transparent.
4. Imagerie confocale
- À l’aide d’un microscope confocal, réglez la longueur d’onde sur 590-650 nm pour Alexa 594 et 410-520 nm pour DAPI. Sélectionnez le format d’image 1024 x 1024 et la moyenne linéaire de 8 pour obtenir des images haute résolution.
- Analysez chaque puits sur la lame à 4 puits au microscope confocal. Acquérez des images de cellules représentatives sous l’objectif 100X, comme illustré à la figure 1 et à la figure 2.
- Pour compter un grand nombre de cellules, prenez des images de champs consécutifs sous l’objectif 40X.
note: Il faut 5 à 10 images pour accumuler plus de 200 cellules infectées à chaque point de chaque infection.
- Dans chaque expérience, prenez des photos avec des paramètres confocaux constants pour tous les échantillons qui doivent être comparés.
5. Analyse de la distribution nucléaire et cytoplasmique
- Ouvrez le projet avec le logiciel d’application confocale. Sélectionnez une image à partir de laquelle les cellules doivent être compilées pour la distribution nucléaire ou cytoplasmique de l’ICP0.
- Cliquez sur l’onglet « Quantité » dans le menu supérieur et sélectionnez « trier les retours sur investissement » dans le menu des outils.
- Tracez une ligne longitudinale à travers la cellule à analyser en sélectionnant « Tracer une ligne » dans le menu supérieur.
note: Un histogramme s’affiche et indique l’intensité de fluorescence le long de la ligne pour ICP0 et DAPI. Dans l’histogramme, la ligne bleue représente les pixels DAPI et marque la limite du noyau tandis que la ligne rouge représente les pixels ICP0.
- Sur la base de la coloration de fond, établissez un seuil constant pour l’intensité de l’ICP0 afin d’analyser la distribution subcellulaire de l’ICP0 dans chaque expérience.
- Comme l’illustre la figure 2, si le signal rouge est en moyenne inférieur au seuil dans la région nucléaire, mais supérieur au seuil au-delà de la limite bleue, classez le signal rouge comme étant principalement situé dans le cytoplasme.
- Si le signal rouge est au-dessus du seuil dans tout le noyau et au-delà de la limite du signal bleu, regroupez le signal rouge en fonction de la localisation du noyau et du cytoplasme.
- Si le signal rouge est au-dessus du seuil dans le noyau, mais qu’il est en moyenne en dessous de celui-ci en dehors de la limite du signal bleu, regroupez le signal rouge comme localisation nucléaire.
- Compilez plus de 200 cellules infectées de chaque échantillon à différents moments d’infection et tracez un graphique à barres pour illustrer le mouvement de l’ICP0 en fonction du temps (figure 3).
