Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Excision chirurgicale et préparation des tissus
- Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale de 1 mL de tribromoéthanol (préparé selon le protocole standard ; Table des matériaux).
note: L’asphyxie au CO2 doit être évitée dans les études pulmonaires car elle pourrait causer des lésions pulmonaires et altérer les caractéristiques et les propriétés des cellules immunitaires pulmonaires. La luxation cervicale doit également être évitée car elle pourrait causer des lésions mécaniques du poumon.
- Transférez la souris dans une zone propre et dédiée à l’opération chirurgicale.
- Stabilisez la souris côté dorsal vers le bas à l’aide d’aiguilles ou de ruban adhésif sur les quatre extrémités. Utilisez de l’éthanol à 70 % pour assainir la peau de la région ventrale.
- Effectuez une incision dans la peau, du cou à l’abdomen. Retirez délicatement la peau de la région thoracique.
- Retirez délicatement le sternum et les côtes.
- Rincer les poumons en injectant 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide directement dans le ventricule droit, à l’aide d’une aiguille de 18 à 21 g, jusqu’à ce que les poumons deviennent complètement blancs.
- Retirez délicatement le thymus et le cœur sans toucher les poumons.
- Détachez doucement les poumons des tissus environnants et transférez-les dans un tube contenant un tampon d’albumine sérique bovine froide (BSA) (tableau 1).
note: Il faut s’efforcer d’éliminer toute la graisse adjacente des poumons avant de préparer davantage la suspension unicellulaire, car cela pourrait biaiser les lectures.
2. Préparation de la suspension unicellulaire
- Transférez les poumons dans une boîte de Pétri vide et hachez-les avec deux scalpels fins. Transférez tous les morceaux du poumon haché dans un nouveau tube conique de 50 ml. Utilisez 5 mL de tampon de digestion pour laver la plaque et ajoutez-la dans le tube de 50 mL contenant le poumon haché (Tableau 1).
note: Le tampon de digestion doit être préparé immédiatement avant utilisation. Utilisez 5 mg/mL de collagénase. L’association de 1 ou 5 mg de collagénase avec un tampon BSA ou un PBS sans protéines n’a pas amélioré les résultats (Figure 1).
- Fixez le couvercle du tube et digérez le poumon pendant 30 minutes sur un agitateur orbital à une vitesse de 150 tr/min à 37 °C. Arrêtez la réaction en ajoutant 10 ml de tampon BSA froid.
- Après la digestion, utilisez une aiguille de 18 G pour mélanger et dissoudre les morceaux de poumon. Placez une crépine filtrante de 70 μm au sommet d’un nouveau tube conique de 50 mL.
note: L’utilisation d’un filtre à microns plus petit peut entraîner la perte de populations myéloïdes importantes.
- Transférez lentement le mélange pulmonaire digéré directement sur la passoire. Utilisez le côté en caoutchouc d’un piston de seringue de 10 ml pour écraser les morceaux de poumon restants sur le filtre. Lavez le matériau traité sur le filtre avec un tampon BSA.
- Centrifuger la suspension à cellule unique à 350 × g pendant 8 min à 4 °C.
- Jeter soigneusement le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK). Bien mélanger à l’aide d’une pipette de 1 mL et incuber pendant 90 s à température ambiante.
- Ajouter 10 mL de tampon BSA froid pour arrêter la réaction et centrifuger à 350 × g pendant 7 min à 4 °C.Jeter soigneusement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans le tampon de coloration pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Remettre les cellules en suspension à une concentration de 5 × 10 à6 cellules/mL et les utiliser pour la coloration de surface (voir rubrique 2).
note: À cette fin, plaquez les cellules dans une plaque à fond rond de 96 puits, suivie d’une coloration et d’un lavage des anticorps. Si une centrifugeuse à plaques n’est pas disponible, utilisez des tubes d’écoulement au lieu de plaques. Avec ce protocole, ~15-20 × 106 cellules par poumon peuvent être obtenues à partir d’une souris C57BL/6 de taille moyenne âgée de 6 à 10 semaines.
3. Coloration des anticorps de surface
- Transvaser 1 × 106 cellules dans 200 μL par puits dans une plaque de 96 puits. Centrifuger la plaque à 350 × g pendant 7 min à 4 °C. Pendant ce temps, préparez la solution du bloc Fc en diluant l’anticorps anti-16/32 (1:100) dans un tampon de coloration (tableau 1).
- Remettre les cellules en suspension dans 50 μL de la solution de blocage du Fc (Table des matériaux) préparée et incuber pendant 15 à 20 min à 4 °C ou sur de la glace.
- Ajouter 150 μL de tampon de coloration et centrifuger la plaque à 350 × g pendant 5 min à 4 °C. Pendant ce temps, préparez le cocktail d’anticorps de surface en diluant les anticorps de surface (1:100 ; Tableau 2) dans le tampon de coloration.
REMARQUE : (i) L’anticorps anti-16/32 pour le blocage Fc peut être utilisé avec les anticorps de surface dans le même mélange. (ii) Si un colorant de viabilité fixable est utilisé, l’ajouter au cocktail d’anticorps de surface à une dilution de 1:1 000.
- Remettre les cellules en suspension dans 50 μL du cocktail d’anticorps de surface pré-préparé et incuber pendant 30 à 40 min à 4 °C dans l’obscurité. Lavez les cellules avec un tampon de coloration deux fois.
note: Si aucune coloration intracellulaire n’est nécessaire, remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon de coloration et procéder directement à l’acquisition des données sur le cytomètre en flux. Alternativement, les cellules peuvent être fixées et stockées à 4 °C pour une acquisition ultérieure. Nous recommandons d’utiliser les cellules pour la cytométrie en flux dans les 24 heures.
4. Fixation cellulaire et coloration intracellulaire
- Préparez le tampon de fixation/perméabilisation (Fix/Perm Buffer) en mélangeant trois parties de concentré de fixation/perméabilisation et 1 partie de diluant de fixation/perméabilisation de l’ensemble de tampons de coloration FoxP3/Transcription Factor (Tableau 1).
- Remettre les cellules en suspension dans 50 μL du tampon Fix/Perm pré-préparé par puits de la plaque à 96 puits, où les cellules ont été plaquées comme décrit à la section 3, et les incuber pendant 20 à 25 minutes à 4 °C dans l’obscurité.
- Diluez le tampon de perméabilisation 10x en 1:10 dans de l’eau déminéralisée purifiée pour préparer un tampon de perméabilisation 1x.
- Lavez les cellules une fois avec 1x tampon de perméabilisation. Pendant ce temps, préparez le cocktail d’anticorps intracellulaires en diluant les anticorps intracellulaires (1:100) dans 1 mL de tampon de perméabilisation.
- Remettre les cellules en suspension à l’aide de 50 μL du cocktail d’anticorps de surface pré-préparé par cellule de la plaque à 96 puits et incuber pendant 40 min à 4 °C dans l’obscurité.
- Lavez les cellules une fois avec un tampon de perméabilisation et une fois avec un tampon de coloration. Après le lavage final, remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon de coloration.
note: S’il n’y a pas de cytomètre en flux avec lecteur de plaques, transférez les cellules dans des tubes de cytométrie en flux.
- Acquérir un minimum de 1,5 × 106 cellules par échantillon sur le cytomètre en flux.
note: Pour les échantillons monochromes et les échantillons de contrôle non colorés, 0,5-1 × 106 cellules par échantillon seront suffisantes. Il est recommandé de titrer les anticorps individuels utilisés pour obtenir une coloration optimale et réduire les coûts. Le protocole actuel a été optimisé à l’aide de Fix/Perm Buffer préparé à l’aide du jeu de tampons de coloration FoxP3. Étant donné que CD68 est un marqueur cytoplasmique et non nucléaire, d’autres solutions de perméabilisation telles qu’une faible concentration de paraformaldéhyde ou des kits cytofix/cytoperm de divers fournisseurs peuvent être suffisantes.
Tableau 1 : Tampons.
| Tampon BSA | PBS + 0,5 % d’albumine sérique bovine |
| Tampon de digestion | Tampon BSA préchauffé (37 °C) + 5 mg/mL de collagénase de type 1 + 0,2 mg/mL de DNase I |
| Tampon de coloration | PBS + 2,5 % FBS |
| Tampon fixe/permanent | Trois parties de diluant de fixation/perméabilisation et 1 partie de diluant de fixation/perméabilisation de l’ensemble de tampons de coloration Foxp3/facteur de transcription |
| Tampon de perméabilisation | 10x tampon de perméabilisation du Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set dilué 10 fois dans de l’eau désionisée purifiée |
Tableau 2 : Utilisation des anticorps monoclonaux.
| antigène | clone | Fluorochrome | dilution | Surface/intracellulaire |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Surface |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | Surface |
| CD68 | FA-11 | Par CPCy5.5 | 1:100 | intracellulaire |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | Surface |
| Siglec F | S17007L | FITC | 1:100 | Surface |
| CD11c | N418 | BV650 ou BV510 | 1:100 | Surface |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/Dazzle 594 | 1:100 | Surface |
| CMH-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | Surface |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Surface |
| Kit de coloration à cellules mortes à lecture lointaine fixable en direct/mort | | FarRed (APC) ou Aqua (BV510) | 1:1000 | Surface |
| CD3 | 17A2 | Pe | 1:100 | Surface |
| Réf. B220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | Surface |
| NK1.1 | Réf. PK136 | FITC | 1:100 | Surface |
| CD24 | 30-F1 | Pe | 1:100 | Surface |
| MERTK | Réf. 2B10C42 | Pe | 1:100 | Surface |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | Surface |
| CX3CR1 | SA011F11 | Pe | 1:100 | Surface |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | | 1:100 | Surface |
