Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de la protéine antigénique HI du SARM
- Obtenir des clones du facteur B déterminant la surface des ions Fe (IsdB) et du mutant de la α-hémolysine (Hla) à partir de sources commerciales (voir le tableau des matériaux), effectuer une amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier les gènes IsdB et Hla, et ligaturer leurs produits au plasmide PGEX-6P-2 (obtenu commercialement ; voir le tableau des matériaux). Dépistage avec la souche vectorielle Xl/bleue d’Escherichia coli.
- Transformer le clone positif en cellules compétentes E. coli BL21 (voir tableau des matériaux) et amplifier avec la culture de requins.
- Exprimer l’antigène et l’isolat après induction avec des kits d’isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside et de chromatographie multimodale (MMC) (voir le tableau des matériaux).
- Caractérisez la protéine antigène et purifiez-la à l’aide d’un purificateur entièrement automatisé.
- Purification d’affinité des protéines marquées à la gutathion S-transférase (GST) à partir de lysats clairs à l’aide d’une résine de chromatographie d’affinité disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- Purifier les protéines recombinantes par isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside et chromatographie multimodale (MMC).
- Éliminez l’endotoxine par la méthode de séparation de phase Triton X-114. En bref, mélanger le Triton X-114 à 1 % avec l’éluat de protéine recombinante à 0 °C pendant 5 minutes pour assurer une solution homogène, et incuber à 37 °C pendant 5 minutes pour permettre la formation de deux phases.
- Utilisez la méthode de test d’endotoxine bactérienne avec les kits Turtle (voir le tableau des matériaux) pour détecter la concentration d’endotoxines. L’endotoxine pour l’antigène protéique est de 0,06 UE/μg, inférieure à la norme internationale (1,5 UE/μg).
- Effectuez un test d’interférence pour éliminer l’influence possible du produit testé sur la détection des endotoxines.
note: Selon l’annexe 2020 de la pharmacopée chinoise, la teneur en endotoxines doit être inférieure à 5 UE/dose. La sensibilité du lysat de Limulus (λ0,25 EU/mL) et le taux de dilution efficace maximal de 33,3 ont été calculés sur la base de la dilution maximale valide, MVD = cL/λ, où L est la valeur limite d’endotoxine bactérienne pour l’article d’essai, c est la concentration de la solution de l’article d’essai, et lorsque L est exprimé en EU/m, c est égal à 1,0 mg/mL. λ est la sensibilité marquée (UE/mL) du réactif de limule dans la méthode sur gel.
- Recombinez l’antigène (48 kDa, déterminé par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium à 12 % [SDS-PAGE]) à 1,5 mg/mL dans de l’eau stérile sans endotoxine ni solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (méthode du dichlorate de sodium).
REMARQUE : Le temps de pic de la protéine était de 13,843 min, la pureté était de 99,4 % (méthode de chromatographie liquide à haute performance) et la protéine a été stockée à -70 °C. L’ADN génomique extrait de la souche de S. aureus MRSA252 (voir le tableau des matériaux) a été utilisé comme modèle PCR. Le gène IsdB a été amplifié à l’aide de l’amorce directe 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 et l’amorce inversée 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39.
Le gène Hla a été amplifié à l’aide de l’amorce directe PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) et de l’amorce inverse PHLAR (TAAGCGGCCGCTTATCAATTTGTCATTTCTTC).
2. Préparation du vaccin à nanoémulsion
- Selon le rapport massique de 1:6:3(p/p), ajoutez trois types d’excipients en séquence (myristate d’isopropyle, huile de ricin polyoxyéthylène et propylène glycol ; voir le tableau des matériaux) à la solution protéique de l’antigène HI (10 mg/mL) et mélangez bien. Ensuite, ajoutez de l’eau pure stérilisée progressivement jusqu’à obtenir un volume final de 10 mL et mélangez à 500 tr/min et 25 °C pendant environ 20 min.
note: La nanoémulsion préparée dans ce protocole a un volume de 10 ml et les masses des trois excipients sont respectivement de 0,34 g, 2 g et 1 g. La solution protéique ici est la solution de travail, 10 fois la concentration de la solution finale.
- Préparer le vaccin adjuvant à base de nanoémulsion (protéine de 1 mg/mL) par des méthodes d’émulsification à faible énergie pour obtenir une solution liquide claire et transparente.
note: La nanoémulsion à blanc (BNE) a été préparée par des méthodes similaires, sauf que l’eau a été remplacée par HI. La méthode habituelle d’émulsification consiste à chauffer les phases externe et intérieure à environ 80 °C pour l’émulsification, puis à les agiter et à les refroidir progressivement. Dans ce processus, une grande quantité d’énergie est consommée et, enfin, l’émulsion est obtenue.
3. Caractérisation physique et stabilité du vaccin adjuvant à base de nanoémulsion
- Caractérisation de la taille des particules, du potentiel zêta et de l’indice de dispersion des polymères (PDI).
- Préparez 100 μL de vaccin adjuvant à base de nanoémulsion et diluez-le 50 fois avec de l’eau pour injection. Ajouter 2 mL d’échantillon pour la détection.
- Observez la taille des particules, le potentiel zêta et le PDI à 25 °C à l’aide d’un nano-zétasiseur (ZS ; voir le tableau des matériaux).
- Microscopie électronique à transmission (MET)
- Diluer 10 μL de vaccin à nanoémulsion 50 fois avec de l’eau, placer sur une grille de cuivre à 100 mailles recouverte de carbone et colorer avec de l’acide phosphotungstique à 1 % (voir le tableau des matériaux) pendant 5 min à température ambiante.
- Retirez l’excès de solution d’acide phosphotungstique avec du papier filtre.
- Observez la morphologie au microscope électronique à transmission (voir Tableau des matériaux). Examinez si les produits finis sont presque stables et circulaires dans le champ de vision du microscope électronique et s’ils présentent une bonne dispersion.
- Microscopie électronique à balayage (MEB)
- Diluer 10 μL du vaccin adjuvant à base de nanoémulsion 50 fois avec de l’eau, déposer 10 μL d’échantillons prédilués sur une plaquette de silicium et les placer dans un incubateur contrôlé par thermostat à 37 °C pendant 24 h.
- Vaporisez le platine préparé sur le silicium pendant 40 s et laissez refroidir à température ambiante.
- Observez les propriétés morphologiques des échantillons préparés au microscope électronique à balayage à haute résolution (voir Tableau des matériaux). Déterminez si les échantillons sont presque stables, sphériques et bien dispersés dans le champ de vision au microscope électronique.
- Stabilité morphologique
- Placer 1 mL d’échantillons de vaccin à nanoémulsion dans des tubes de microcentrifugation, et évaluer la stabilité d’échantillons frais par centrifugation pendant 30 min à 13 000 x g à température ambiante (25°C).
- Observez l’aspect de ces échantillons frais, puis effectuez un test de stabilité thermodynamique de six cycles de température (un cycle : stocker à 4 °C pendant 48 h, 25 °C pendant 48 h et 37 °C pendant 48 h).
- Après la centrifugation, laisser reposer les échantillons pendant 15 minutes pour déterminer s’il y a un effet Tyndall (si l’échantillon est clair et transparent à la lumière) et s’il y a eu désémulsification (comme le montre une stratification claire après désémulsification).
- SDS-PAGE et western blot
- Agiter les échantillons, mélanger une solution de 0,6 mL d’éthanol absolu et de 0,3 mL de vaccin et centrifuger (13 000 x g, 30 min à température ambiante, 25 °C).
- Transférez le surnageant de la solution dans un tube propre et dissolvez le précipité avec 0,3 mL d’eau. Obtenez les solutions surnageante et précipitée (nanoémulsion à blanc et vaccin) après traitement avec une solution d’éthanol absolu et d’eau distillée, et effectuez la même dilution 50 fois.
- Mélangez 2,5 ml de gel de séparation A et 2,5 ml de gel de séparation B (voir le tableau des matériaux), ajoutez 50 μL de persulfate d’ammonium à 10 % et placez rapidement la solution dans la plaque de verre à l’aide d’une pipette. Mélangez 1 mL de gel concentré A et 1 mL de gel concentré B, ajoutez 20 μL de persulfate d’ammonium à 10 % dans la plaque de verre, insérez un peigne de taille appropriée et attendez la solidification.
- Ajouter un total de 5 μL de solution tampon de charge protéique 5x à l’échantillon dilué obtenu à l’étape 3.5.2 et faire bouillir l’échantillon pendant 5 min.
- Ajoutez 10 μL de protéines chauffées dans le puits correspondant et ajoutez 5 μL de marqueur protéique dans le puits marqueur.
- Connectez l’électrode, allumez l’électrophorèse (voir le tableau des matériaux) et réglez la tension à 300 V. Coupez l’alimentation lorsque l’électrophorèse atteint 1 cm du bas du caoutchouc PAGE.
- Retirez le gel et rincez à l’eau bi-distillée (ddH2O). Ajouter la solution de coloration bleu vif Coomassie G-250 (voir le tableau des matériaux) pendant 10 min. Versez la solution de coloration et rincez le gel deux fois avec la solution et la solution de décoloration disponible dans le commerce et passez le gel au micro-ondes pendant 1 min. Agitez le gel pendant 10 minutes et changez à plusieurs reprises la solution de décoloration jusqu’à ce que le fond du gel soit clair. Ensuite, effectuez une imagerie sur gel (voir Tableau des matériaux).
note: Le transfert Western a été prétraité, comme décrit aux étapes 3.5.1 à 3.5.6.
- Trempez trois blocs de papier filtre avec un tampon de transfert d’électrophorèse. Faites tremper la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) dans du méthanol pendant 30 secondes et transférez-la avec un instrument de transfert de gel semi-sec (deux couches de papier filtre, une membrane PVDF, un gel d’électrophorèse et une couche de papier filtre). Utilisez une tension de 23 V pour transférer la membrane pendant 23 min.
- Retirez la membrane PVDF et lavez-la une fois avec du saline-Tween 20 (TBST) tris-buffered salin (TBST) après le transfert.
- Placer la membrane PVDF dans une solution d’étanchéité (solution de lait écrémé en poudre à 5 %) et sceller toute la nuit à 4 °C.
- Retirez la membrane PVDF et lavez-la trois fois avec du TBST ou 10 min chacune.
- Incuber avec l’anticorps primaire (provenant de souris immunisées avec un sérum positif). Diluer l’anticorps primaire (voir le tableau des matériaux) à tester 500 fois (100 fois) avec le TBST. Placez la membrane PVDF bloquée dans l’anticorps primaire et incubez à 37 °C pendant 1 h.
- Retirez la membrane PVDF et lavez-la trois fois avec du TBST pendant 10 min chacune.
- Incuber avec l’anticorps secondaire (voir le tableau des matériaux). Anticorps secondaire de chèvre anti-souris marqué à la phosphatase alcaline (AP) diluée 5 000 fois avec TBST. Placez la membrane PVDF dans l’anticorps secondaire et incubez à 37 °C pendant 40 min.
- Retirez la membrane PVDF et lavez-la quatre fois avec du TBST pendant 10 minutes chacune.
- Immergez les membranes PVDF dans un mélange (juste assez pour tremper la membrane) du substrat AP nitro blue tetrazole (NBT) et BCIP (5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine salt) (voir le tableau des matériaux) pour la coloration. Un résultat positif est purple.
REMARQUE : Les résultats doivent être une bande violette claire, et la bandelette d’échantillon et le poids moléculaire de l’antigène doivent être à la même position étiquetée.
4. Évaluation de la réponse immunitaire des anticorps à ce vaccin après administration intramusculaire
REMARQUE : Les souris ont été immunisées par injection intramusculaire du vaccin à nanoémulsion à la suite de la publication d’un rapport. Les souris ont reçu du PBS en tant que contrôle négatif. À 1 semaine après trois vaccinations, le sérum a été prélevé sur les souris. Les taux sériques d’IgG et de sous-classes d’IgG1, d’IgG2a et d’IgG2b ont été déterminés quantitativement par immuno-enzymatique (ELISA).
- Enrobage de l’antigène : Diluer l’antigène de la protéine HI à 10 μg/mL avec une solution d’enrobage et l’ajouter à la plaque ELISA à 100 μL/puits. Incuber à 4 °C pendant la nuit.
note: La solution d’enrobage est préparée en dissolvant 1,6 g de carbonate de sodium anhydre et 2,9 g de bicarbonate de sodium dans 1 L d’eau déminéralisée.
- Scellage : Laver la plaque (trois cycles, 300 μL chacun). Ajouter 300 μL de la solution d’étanchéité dans chaque puits et sceller les puits pendant 2 h à 37 °C.
note: La solution d’étanchéité est préparée en ajoutant du Tween-20 et de l’albumine sérique bovine (BSA) au PBS. La teneur en BSA dans la solution PBST est de 1 %.
- Dilution sérique : Diluez l’échantillon de sérum de souris 100 fois avec du PBST (prélevez 3 μL de sérum et ajoutez-le à 297 μL de PBST et de vortex), et utilisez 100 μL pour chaque échantillon de sérum. Diluez le sérum positif et le sérum témoin négatif 100 fois avec du PBST en ajoutant 4 μL à 396 μL de PBST, puis mélangez par vortexing.
- Dilution à double rapport : Ajouter 200 μL du sérum expérimental dilué ci-dessus à la première rangée de la plaque ELISA revêtue, et ajouter 100 μL de PBST à tous les puits sauf la première et la 12e rangée. Effectuez une dilution 1:2 successivement à partir de la première rangée : ajustez la pipette à 100 μL, transférez 100 μL de la première rangée à la deuxième rangée et mélangez 10 fois avec la pipette.
- Diluez le sérum jusqu’à la rangée 11 à plusieurs doses et jetez 100 μL de liquide.
- Ajouter le sérum négatif et positif dilué dans les puits correspondants de la rangée 12 selon le modèle d’échantillon (voir le tableau 1) - 100 μL/puits.
- Scellez les plaques ELISA avec une pellicule plastique et incubez à 37 °C pendant 1 h.
- Anticorps secondaires dilués contre les IgG-HRP de souris (voir tableau des matériaux) avec PBST à 1:10 000.
- Lavez la plaque (trois cycles, chaque cycle 300 μL). Ensuite, ajoutez 100 μL de l’anticorps secondaire dilué dans chaque puits et incubez la plaque à 37 °C pendant 40 min.
- Coloration et terminaison : Laver la plaque (cinq cycles, chaque cycle 300 μL). Ajouter une solution de coloration à la 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) (100 μL ; voir le tableau des matériaux) dans chaque puits. Placez les plaques à 37 °C pendant 10 min à l’abri de la lumière, puis terminez immédiatement la réaction avec 50 μL de 2 M H2SO4.
- Détecter la valeur de densité optique (OD450) à l’aide d’un marqueur enzymatique (lire la valeur OD450 dans les 15 minutes suivant l’arrêt).
Tableau 1 : Séquence de pic ELISA et modèle de dilution.
