1. Évaluation du clivage ou de la dégradation des protéines dans le virus de la grippe A, cellules infectées par l’IAV par les caspases
- Grainez 3 x 105 cellules de rein canin de Madin-Darby (MDCK) ou A549 par puits dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits.
note: Si vous utilisez des cellules MDCK, assurez-vous que l’anticorps contre la protéine d’intérêt reconnaît son espèce canine.
- Ensemencer les puits par paires, c’est-à-dire une paire témoin - un puits pour l’échantillon fictif non infecté et un pour l’échantillon fictif infecté, une paire de tests - un puits pour l’échantillon A inhibiteur non infecté et un pour l’échantillon A inhibiteur infecté. Augmentez le nombre de paires avec chaque inhibiteur supplémentaire.
- Incuber les cellules à 37 °C sous une atmosphère à 5 % de CO2 pendant la nuit.
- Le lendemain, infectez les cellules avec l’IAV (un sous-type H1N1 ou un autre sous-type).
- Pour cela, préparez l’inoculum viral en diluant le stock de virus dans 400 μL de milieu essentiel minimum (MEM) sans sérum (voir le tableau des matériaux) à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,5 à 3,0 unités formant une plaque (pfu)/cellule (un facteur de doublement du nombre de cellules lors du calcul du MOI).
note: Pour infecter les cellules MDCK, compléter l’inoculum viral avec du tosyl phénylalanyl chlorométhyl cétone (TPCK)-trypsine à une concentration finale de 1 μg/mL.
- Retirez l’ancien milieu de culture des cellules (étape 1.3) et lavez les cellules avec 1 ml/puits de MEM 2x sans sérum.
- Ajouter 400 μL d’inoculum viral (étape 1.4.1) aux cellules et les incuber pendant 1 h à 35 °C sous une atmosphère de dioxyde de carbone (CO2) à 5 %.
- Entre-temps, diluez un inhibiteur de caspase (par exemple, Z-DEVD-FMK), un inhibiteur de lysosome (par exemple, chlorure d’ammonium, NH4Cl) ou un inhibiteur de protéasome (par exemple, MG132) (voir le tableau des matériaux) à une concentration finale de 40 μM, 20 mM ou 10 μM, respectivement, dans du MEM sans sérum (voir le tableau des matériaux). Les deux derniers inhibiteurs servent de contrôle. Diluer un volume égal du solvant (s’il n’est pas de l’eau) utilisé pour reconstituer l’un des inhibiteurs dans un milieu sans sérum comme un simulacre.
- Retirez l’inoculum du virus et lavez les cellules comme à l’étape 1.5 (1x).
- Ajouter le MEM sans sérum, 1 mL/puits, simulé ou complété par un inhibiteur, aux cellules et incuber les cellules comme à l’étape 1.6. Ce point de temps est considéré comme une infection à 0 h.
- Après 24 h, récoltez les cellules en les grattant à l’aide d’un piston de seringue de 1 mL (côté caoutchouc) et transférez-les dans un tube en polypropylène de 1,5 mL.
- Centrifugez le tube à 12 000 x g pendant 1 à 2 min à température ambiante. Prélever le surnageant à l’aide d’une pipette.
note: Ce surnageant pourrait être éliminé ou utilisé pour un test de plaque afin de mesurer le titre de la descendance du virus libéré.
- Lavez la pastille cellulaire avec 250 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par recentrifugation comme à l’étape 1.11.
- Retirez le surnageant et lysez les cellules en ajoutant 80 à 100 μL de tampon de lyse cellulaire (50 mM de chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (THAM) (Tris-HCl), pH 7,4, 150 mM de chlorure de sodium (NaCl), 0,5 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), 0,5 % de désoxycholate de sodium, 1 % de Triton X-100 et 1x cocktail d’inhibiteur de protéase, voir le tableau des matériaux) et le vortex.
- Chauffer le tube à 98 °C pendant 10 min pour lyser complètement et préparer le lysat cellulaire total. Conservez les lysats à 4 °C pour effectuer les étapes 1.15-1.17 le lendemain, mais, pour de meilleurs résultats, terminez ces étapes le même jour.
- Estimez la quantité de protéines dans chaque échantillon à l’aide d’un kit de dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) (voir la table des matériaux).
- Éliminez des quantités égales de protéines à partir d’échantillons non infectés et infectés par électrophorèse standard sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) avec des marqueurs de poids moléculaire.
- Transférez la protéine dans une membrane de nitrocellulose ou de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (voir le tableau des matériaux).
note: La membrane PVDF peut donner un bruit de fond élevé dans certains imageurs Western Blot ; Vérifiez la compatibilité.
- Effectuez un western blot pour détecter la protéine d’intérêt en utilisant la méthode décrite ailleurs.
- Comparez les niveaux de protéines dans les couloirs d’échantillons infectés traités par simulation et par inhibiteur.
note: Si le niveau de protéine s’est rétabli dans la voie d’échantillon infectée traitée par un inhibiteur de caspase, la protéine est clivée ou dégradée par les caspases. Sinon, il est dégradé par le lysosome ou le protéasome.
- Quantifiez la récupération de la protéine en mesurant l’intensité de sa bande dans chaque voie à partir d’au moins trois répétitions de la même expérience et en la normalisant avec la bande de contrôle de charge correspondante.
- Utilisez n’importe quel imageur contemporain et les logiciels associés (voir la Table des matériaux) pour imager les transferts Western et quantifier la récupération des protéines.
