1. Évaluation de l’activité antimicrobienne
REMARQUE : Tous les travaux impliquant des bactéries doivent être effectués dans des conditions stériles afin d’éviter la contamination du test ou du laboratoire. Tous les milieux doivent être autoclavés avant utilisation, et les objets en plastique et les équipements tels que les pipettes doivent être maintenus stériles. Il est recommandé d’effectuer les travaux dans une hotte de bioconfinement (type 2).
- Étalez les stocks de glycérol de souches bactériennes appropriées pour l'échafaudage antibiotique sur une gélose au bouillon de lysogénie (LB, préparée selon les instructions du fabricant) et faites croître pendant la nuit à 37 °C
note: Le choix des bactéries pour tester l’activité antibactérienne doit être fait en fonction de l’échafaudage antibiotique utilisé. Une gamme représentative de 5 à 10 bactéries doit être choisie parmi les espèces connues pour être sensibles à l’antibiotique, en tenant compte des capacités logistiques du laboratoire. Si possible, les bactéries résistantes doivent également être testées. Le protocole donné ci-dessous fonctionnera sur la plupart des bactéries, mais vérifiez si des conditions spéciales sont requises (par exemple, CO2, milieux spéciaux) et apportez des modifications si nécessaire. Les bactéries testées avec succès à l’aide de ces conditions comprennent les staphylocoques, les streptocoques, les bacilles, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Enterococcus faecium.
- Prélever une seule colonie dans l’assiette et faire cultiver toute la nuit dans 5 ml de bouillon Mueller-Hinton ajusté en cations (CAMHB, préparé selon les instructions du fabricant) à 37 °C.
- Diluer les cultures de nuit ~40 fois dans du CAMHB et les faire croître jusqu’à une phase mi-logarithmique, densité optique à 600 nm (DO600) = 0,4–0,8, volume 5 mL).
- Préparez des solutions mères de chaque antibiotique fluorescent à raison de 1,28 mg/mL dans de l’eau stérile et pipetez 10 μL d’antibiotique dans la première colonne d’une plaque à 96 puits.
- Ajouter 90 μL de CAMHB dans la première colonne et 50 μL dans tous les autres puits. Ensuite, effectuez une dilution en série de 2 fois sur la plaque.
- Bien mélanger, puis diluer les cultures en phase mi-logarithmique à ~106 unités formant colonies (UFC)/mL et ajouter 50 μL à tous les puits, pour obtenir une concentration finale de ~5 x 105 UFC/mL.
volume de culture (mL) = (volume du milieu en mL)/(DO600 x 1 000)
p. ex., pour une DO600 = 0,5 culture dans un volume de milieu souhaité de 12 ml, ajouter (12/(0,5 x 1 000) = 0,024 mL de culture à 12 mL de milieu
- Couvrez les plaques avec des couvercles et incubez à 37 °C pendant 18 à 24 h sans secouer.
- Inspectez visuellement les plaques, le MIC étant le puits de concentration le plus faible, sans croissance visible.
note: Voir le tableau 1 pour quelques exemples d’antibiotiques fluorescents actifs et inactifs.
2. Analyse de l’accumulation de sondes par spectrophotométrie
REMARQUE : Ces temps de centrifugation ont été optimisés pour E. coli, de sorte que de légères modifications peuvent être nécessaires pour d’autres espèces. Des données représentatives de l’accumulation de la sonde sont rapportées pour la sonde de ciprofloxacine marquée au NBD.
- Étalez les stocks de glycérol des souches bactériennes sur la gélose LB et faites croître pendant la nuit à 37 °C.
- Prélever une seule colonie dans la plaque et cultiver toute la nuit à LB à 37 °C.
- Diluer les cultures de nuit ~50 fois dans le milieu et les faire croître jusqu’à la phase mi-log (DO600 = 0,4 à 0,8).
- Centrifuger les cultures à 1 470 x g pendant 25 min et décanter le milieu.
- Remettre les bactéries en suspension dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis centrifuger à 1 470 x g pendant 15 min.
- Décantez le média et remettez en suspension les granulés lavés dans du PBS jusqu’à ce qu’ils atteignent une DO finalede 600 = 2.
- Si désiré, ajouter 10,1 μL de cyanure de carbonyle 3-chlorophénylhydrazone (CCCP, 10 mM dans PBS) à 1 mL de bactéries (concentration finale 100 μM) et incuber à 37 °C pendant 10 min
note: CCCP est un inhibiteur de la pompe d’efflux. L’ajout du CCCP permettra d’examiner l’impact des efflux.
- Centrifuger les cultures à 18 000 x g pendant 4 min à 20 °C et décanter le milieu.
- Ajouter 1 mL de solution antibiotique fluorescente (10 à 100 μM dans du PBS) à la pastille et incuber à 37 °C pendant 30 min.
- Centrifuger les cultures à 18 000 x g pendant 7 min à 4 °C et décanter le milieu.
- Remettez les bactéries en suspension dans 1 mL de PBS froid et répétez l’étape 2.9.
- Répétez l’étape 2.10 4 fois au total.
- Si vous le souhaitez, lyser les bactéries en ajoutant 180 μL de tampon de lyse (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 et 2 mM d’EDTA sodique) puis 70 μL de lysozyme (72 mg/mL dans H2O).
- Incuber à 37 °C pendant 30 min, puis congeler-décongeler 3 fois (-78 °C pendant 5 min, puis 34 °C pendant 15 min).
- Soniquer les échantillons pendant 20 min, puis chauffer à 65 °C pendant 30 min.
- Centrifuger les échantillons lysés (18 000 x g, 8 min), puis filtrer à travers une membrane filtrante de 10 kDa.
- Lavez le filtre 4x avec 100 μL d’eau.
- Transférez le lysat sur une plaque noire à 96 puits à fond plat et mesurez l’intensité de fluorescence sur un lecteur de plaque avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées pour le fluorophore (c’est-à-dire 7-(diméthylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl [DMACA] : λex = 400 nm, λem = 490 nm ; nitrobenzoxadiazole [NBD] : λex = 475 nm, λem = 545 nm).
note: Voir la figure 1 pour des exemples d’analyses spectrophotométriques de bactéries à l’aide de l’antibiotique ciprofloxacine marqué au NBD fluorescent .
