Analyse morphologique des Drosophile Larvaires périphérique dendrites et des axones des neurones sensoriels utilisant mosaïques génétiques

Résumé

Les neurones sensoriels de l'arborisation dendritique des Drosophile Larvaires système nerveux périphérique sont des modèles utiles pour élucider la fois générales et spécifiques à chaque classe neurone mécanismes de la différenciation neuronale. Nous présentons un guide pratique pour générer et analyser dendritiques arborisation neurone mosaïques génétique.

Résumé

Développement du système nerveux requiert la spécification correcte de la position du neurone et de l'identité, suivie par le développement des neurones dendritiques précise classe spécifique et le câblage axonal. Récemment, le dendritiques arborisation (DA) des neurones sensoriels de l'Drosophile larvaire du système nerveux périphérique (SNP) sont devenus puissants modèles génétiques dans lesquels d'élucider les mécanismes à la fois générales et spécifiques à chaque classe de la différenciation neuronale. Il ya quatre principales classes de neurones DA (I-IV) ^1. Ils sont nommés dans l'ordre croissant de complexité des dendrites tonnelle, et ont de la classe des différences spécifiques dans le contrôle génétique de leur différenciation ^2-10. Le DA système sensoriel est un modèle pratique pour étudier les mécanismes moléculaires derrière le contrôle de la morphologie dendritique ^11-13 parce que: 1) il peut profiter de l'puissants outils génétiques disponibles chez la drosophile, 2) le neurone DA dendrite tonnelle se propage en seulement deux dimensions sous un article optiquementar des larves cuticule rendant facile à visualiser en haute résolution in vivo, 3) la diversité des classes spécifiques de morphologie dendritique facilite une analyse comparative de trouver des éléments clés contrôlant la formation de simples vs très ramifiées arbres dendritiques, et 4) dendritiques tonnelle stéréotypées formes de neurones DA différents de faciliter les analyses statistiques morphométriques.

DA neurone modifie l'activité de la sortie d'un générateur de pattern de locomotion des larves centrale ^14-16. Les différentes classes de neurones DA ont des modalités sensorielles distinctes, et leur activation provoque différentes réactions comportementales ^14,16-20. Par ailleurs des classes différentes envoyer des projections axonales stéréotypée dans le système central de la drosophile larvaires nerveux dans la corde nerveuse ventrale (VNC) ^21. Ces projections se terminent par des représentations topographiques de deux neurones DA modalité sensorielle et la position dans la paroi du corps du champ dendritique ^7,22, 23. Ainsi l'examen des projections axonales DA peut être utilisée pour élucider les mécanismes qui sous-tendent la cartographie topographique ^7,22,23, ainsi que le câblage d'un circuit simple de locomotion des larves modulant ^14-17.

Nous présentons ici un guide pratique pour générer et analyser les mosaïques génétiques marquant ²⁴ neurones DA via MARCM (Analyse mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible) ^1,10,25 et FLP-out ^22,26,27 techniques (résumées dans la Fig. 1).

Protocole

1.Préparation de réactifs

1. Préparer Ca ^{+ +} libre HL3.1 salée ^28.
   1. En mm: 70 NaCl, KCl 5, 20 _MgCl2, 10 NaHCO _3, HEPES 5, 115 le saccharose, le tréhalose et 5; pH 7,2. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
      Note: Ca ⁺ solution ⁺ libre empêche la contraction des muscles lors de la dissection.
2. Faire de poly-L-lysine (PLL) lamelles.
   1. Dissoudre 100 mg de PLL dans l'eau 4,2 ml et de faire des aliquots 300μl dans des tubes Eppendorf et congeler à -20 ° C.
   2. Avant de lamelles de revêtement, premier dégel d'une partie aliquote, le mettre à 10ml dans le trou DDH ₂ O et d'ajouter 20 pi de Kodak Photo-Flo, la concentration finale de PLL est de 0,7 mg / ml.
   3. Plonger des lamelles pour les 30mins dans une solution de PLL, enlever et sécher, puis rincer rapidement à l'eau et à sec. Répéter deux fois. Lamelles traitées durer environ un mois.

2. Croisements génétiques

1. To générer des clones MARCM. Voici par exemple une croix en utilisant un pilote pan-DA ^11,27:
   FRT2A x hsFLP; Gal4 ^{109 (2) 80,} SAMU-mCD8:: GFP; baignoire-GAL80 FRT2A/SM5-TM6B
2. Pour générer Flp-out clones. Voici une croix par exemple en utilisant une classe IV-pilote spécifique ^8:
   PPK-Gal4 x yw, hsFLP; SAMU-FRT-CD2, y ^{+-stop-FRT-mCD8::} GFP

3. Collecte des embryons

1. Gardez drosophile croise dans une bouteille de collection à 25 ° C et de recueillir des embryons sur un jus de pomme gélose ²⁹ répandit avec une fine couche de pâte de ^30,31 levure.

4. Traitement par choc thermique des embryons

1. Placer une assiette vide en opposition à la plaque de gélose de pomme jus de sur lequel les embryons ont été posées. Seal autour de ces deux plaques avec du parafilm (Fig. 2).
2. Lors de choc thermique ème submerger,Plaque e dans le bain d'eau et la maintenir enfoncée en utilisant un poids de métal.
3. Pour les embryons MARCM
   1. Recueillir des embryons pour 2h et incuber dans un plat de 10cm de Pétri entouré par des tissus humidifié à 25 ° C pour une 2h supplémentaires.
      Remarque: Régler le protocole de choc thermique modifie la fréquence à laquelle les clones sont générés.
   2. Pour un plus petit nombre de clones, visant simples neurones isolés, submerger et de choc thermique dans le bain-marie pendant 1h à 38 ° C.
   3. Pour un plus grand nombre de clones, de choc thermique pour les 45mins à 38 ° C, de récupérer à la température ambiante 30 minutes, puis un choc thermique à nouveau pour une 30mins supplémentaires.
4. Recueillir Flp-out embryons pour 24h, et le choc thermique pour 1h à 38 ° C.

5. Le dépistage de clones

1. Après un choc thermique, enlevez le couvercle de l'arrangement étanche à l'eau et placez la plaque de gélose de pomme jus dans une boîte de Pétri 10cm entourées de tissus humidifiés. Culture des embryons et des larves subséquentes à 25 ° C jusqu'à ce que se promenerING 3 ^ème stade.
   Remarque: les conditions de culture, en particulier la nutrition, ont été montré de modification DA morphologie dendritique tonnelle ^32,33. Assurez-vous que les larves de plus en plus avoir accès à la pâte de levure à tout moment, de suivre et reconstituer la levure coller comme requis.
2. De ce point dans le protocole de partir, manipuler délicatement avec une pince les larves d'insectes.
3. Brièvement et rincer doucement les larves dans l'eau du robinet, puis placez-les sur une plaque de gélose.
   Remarque: Cette étape permet de réduire de fond auto-fluorescence de la nourriture ou de saleté sur la surface des larves.
4. Examiner les larves sous un microscope à fluorescence puissante dissection. Identifier les larves avec GFP-positives neurones / cellules de la paroi du corps.

6. Imagerie in vivo dans des dendrites

1. Placer la larve dans un verre à glisser la dépression avec une petite goutte de glycérine à 80%. Placer une lamelle sur la lame d'immobiliser la larve. Assurez-vous que l'air ne reste entre la larve et l'coverslip.
2. Poussez doucement la lamelle à rouler la larve pour permettre la visualisation du neurone d'intérêt. L'image de la mCD8:: GFP-étiquetée tonnelle dendritiques par microscopie confocale.

7. Dissection des larves

Notez avant de commencer: DA dendrites neuronales se dégrader rapidement après le début de la dissection. Disséquer chaque larve individu dans moins de 5min à assurer la morphologie des dendrites bon.

1. Disséquer errance 3 ^e stade larvaire sur une plaque Sylgard comme décrit précédemment ³⁴ avec les modifications suivantes:
   1. Pour l'imagerie des neurones DA Termini axone, s'assurer que le système nerveux central est intact et les nerfs segmentaires ne sont pas brisés. Après l'ouverture de la larve, d'abord soigneusement couper les connexions trachéale à la paroi du corps puis retirez délicatement le tube digestif entier.
   2. Si l'imagerie des dendrites seul, enlever la SNC pour permettre à un plat de montage.

8. Fixation et le blocage des filets larvaires

1. Avec la larve encore épinglé à la plaque Sylgard, le fixer dans PFA 4% dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante sur une légère rotation shaker.
2. Supprimer les traces des tissus larvaires (la graisse corporelle, la trachée, etc) après fixation.
3. Laver dans du PBST (PBS avec 0,1% de Triton X-100) 10mins 3x sur la plaque Sylgard et agitateur. Si l'examen de Termini axone, garder le filet sur la plaque Sylgard. (Si dendrites coloration, il est possible de transférer les filets des larves dans un tube de 0,5 ml à cette étape ³⁴⁾
4. Bloquer les larves pendant 20 minutes à température ambiante dans 5% des taux sériques normaux âne (NDS) dans PBST sur un agitateur.

9. Coloration des filets larvaires

1. Retirer la solution de blocage et incuber en anticorps primaire (dans 5% NDS / PBST) nuit à 4 ° C dans un petit récipient Tupperware entouré par humidifié tissus.
2. Retirer les tubes de 4 ° C et incuber une heure supplémentaire à température ambiante.
3. Lavez 10mins 6x dans le PBST. Ajouter le ANTIB secondairesOdy (dans 5% NDS / PBST), et le couvercle pour éviter la photo-blanchiment fluorophore ^34.
4. Incuber soit à température ambiante pendant deux heures ou une nuit à 4 ° C suivie d'une heure à température ambiante.
5. Laver les larves 6x 10 minutes dans du PBST et procéder à un montage.

10. Montage des filets de larves d'examen de la tonnelle dendrite

1. Mont chaque filet des larves aussi plate que possible en utilisant des ciseaux de dissection ou un scalpel pour couper la tête (y compris les crochets bouche), et la partie arrière (y compris les stigmates) ^34.
2. Mettez le filet des larves sur la diapositive cuticule vers le bas, montez dans le glycérol 80%, et sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles pour une «rapide» de montage ^34.
3. Pour un montage permanent et une image plus claire
   1. Placer le filet de muscles disséqués larves vers le bas sur une goutte de PBS sur une lamelle de PLL, il sera rapidement adhérer à la lamelle.
   2. Retirez autant de liquide que possible après le montage, uter ne lui permettent pas de sécher complètement.
   3. Prenez la lamelle (avec filet de larves jointe) grâce à une série d'éthanol: l'éthanol 35%, suivie par 50%, 70%, 95%, et enfin 2x éthanol à 100% pour chacun des 10 minutes (le 2ème solution 100% EtOH doit être changé fréquemment ), et enfin, laver 2-3x 10 minutes dans le xylène.
   4. Mettre une goutte de milieu de montage DPX (Xylène Plastifiant Distyrene) sur une lame propre et soigneusement préparer le filet de la lamelle à l'envers sur le dessus. Gardez à l'obscurité, et d'attendre une journée pour le DPX de mettre en avant l'imagerie.

11. Montage des filets de larves d'examen des terminus axone

1. Gardez les nerfs segmentaires courant entre le PNS et le SNC intacte lors de la dissection, la fixation et coloration afin de permettre le traçage des axones des neurones périphériques du corps de cellules sensorielles de la VNC.
2. Montez chaque filet de la cuticule des larves vers le bas dans 80% de glycérine dans une diapositive dépression. Trace les axones du corps cellulaire DA auVNC sous le microscope confocal. Remarque: PNS neurones dans chaque projet segment du corps mur pour le segment apparenté de la VNC.

12. Les résultats représentatifs:

Les résultats représentatifs sont présentés dans les figures 3-5. Fig. 3 montre la tonnelle entière d'un neurone de classe IV da, capturé in vivo sous le microscope confocal. Fig. 4 montre un gros plan d'une partie de la tonnelle d'un dendrite immunohistochimiquement étiquetés neurone de classe III qui a été correctement fixé afin de préserver la morphologie. L'encart montre la dégradation associée qui peut survenir après une dissection infructueuses et la fixation (deux colorés avec des anticorps anti-GFP). Fig. 5 montre une seule classe IV axone terminal dans le SNC (anti-GFP, vert); tous les terminus de classe IV sont co-colorés avec anti-CD2 (magenta).

Figure 1 Aperçu Protocole. a) Recueillir et ensuite de choc thermique embryons. b) Sélectionnez une larve avec un clone GFP-positives DA neurone, puis l'image de la GFP-étiquetée dendrite tonnelle dans la larve vit. c) Disséquer la larve, puis immunohistochimiquement tacher le filet. d) Monter le filet taché, puis l'image de la tonnelle dendritiques et projections axonales des neurones DA les clones.

Figure 2: préparation de la plaque de gélose de pomme jus pour choc thermique. Prenez la plaque (flèche blanche, AB), ajouter un second plat de Pétri sur le dessus (flèche rouge b) et joint d'étanchéité autour de Parafilm (flèche bleue, b).

Figure 3 en image in vivo de la tonnelle d'un dendrite mCD8:: GFP-étiquetée clone MARCM (génotype comme en 2.1), représentant une classe IV (v'ada) neurone d'une larve de 3 ^e stade larvaire. La barre d'échelle est 50 microns.

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Figure 4 mCD8:: GFP-étiquetée clone MARCM d'un neurone de classe III (ddaA) colorés avec des anticorps anti-GFP, montrant une bonne morphologie après dissection réussie et la fixation (en vert). L'encart montre la dégradation des dendrites (flèches blanches) survenant après la dissection infructueuses et la fixation (magenta). La barre d'échelle est 25 um.

Figure 5 La 3 ^e stade larvaire VNC. Un clone Flp-out d'un terminus de classe VI seul axone (VDAB) (génotype comme en 2.2) est détecté à l'aide d'anticorps anti-GFP (vert). Anti-CD2 étiquettes tous les terminus de classe IV (magenta). La barre d'échelle est 25 um.

Discussion

La Drosophile larvaire DA neurone modèle fournit un excellent système pour étudier les mécanismes génétiques que la morphologie des neurones de contrôle et de la formation des circuits. MARCM est généralement utilisé pour l'étiquetage et pour générer des clones mutants DA neurone. Pour MARCM nous utilisons soit un pan-neural (p. ex Gal4 ^C155) ou spécifique des neurones DA pilote. L'utilisation d'un pilote pan-neuronal, il est possible d'utiliser directement plusieurs ...

Matériaux

Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
SZX16 microscope à dissection de fluorescence (avec GFPHQ filtre)	Olympus	SZX16
Pince en direct insectes	TSF	26030-10
26mm x 76mm en verre glisser la dépression	Toshinriko Co.	T8-R004
Sylgard 184 (ou Silpot 184)	Dow Corning	3097358-1004
Poly-L-lysine	Sigma	P-1524	Ce produit a prouvé plus efficace
DPX milieu de montage	Sigma	44581
Lapin anti-GFP	Invitrogen	A-11122	Dilution 1:500
Rat anti-CD8	Caltag	5h10	Dilution 1:200
Souris anti-CD2	AbD serotec	MCA443R	Dilution 1:700
Souris anti-Fasciclin2	DSHB	1D4	Dilution 1:10