Normothermique arrêt cardiaque et la réanimation cardiorespiratoire: un modèle murin de l'ischémie-reperfusion

Résumé

Un modèle puissant pour les soins de blessures liées périopératoires et critiques rénale aiguë est présenté. En utilisant une hypoperfusion corps induites par arrêt cardiaque, il est possible à près de répliquer les modifications histologiques et fonctionnelles des cliniques AKI.

Résumé

Lésions rénales aiguës (IRA) est une commune, très meurtrières, complication d'une maladie grave qui entraîne une mortalité élevée ^1-4 et qui est le plus souvent causées par une hypoperfusion l'ensemble du corps. ^5,6 reproduction réussie d'hypoperfusion l'ensemble du corps dans des modèles rongeurs a été semé d'embûches. ^7-9,9,10 modèles qui emploient une ischémie focale ont démontré à maintes reprises des résultats qui ne traduisent pas la situation clinique, et des modèles animaux plus gros qui permettent l'accès du corps manque toute une hypoperfusion de la boîte à outils complète de la manipulation génétique possible dans la souris. ^11,12 Cependant, ces dernières années un modèle de souris d'un arrêt cardiaque et de réanimation cardio-respiratoire a émergé qui peut être adapté pour modéliser AKI. ¹³ Ce modèle reproduit de manière fiable physiologiques, les résultats fonctionnels, anatomiques et histologiques vu dans AKI cliniques , est rapidement répétitif, et offre tous les avantages significatifs d'un modèle murin de chirurgie, y compris l'accès aux ressources génétiques et des techniques de manipulation, par rapport à faible coût pour les grands animaux, et la facilité d'utilisation. Notre groupe a développé une vaste expérience de l'utilisation de ce modèle pour évaluer un certain nombre d'organes spécifiques dans les résultats AKI. ^14,15

Protocole

Toutes les procédures décrites sont réalisées en conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices pour le soin et l'utilisation des animaux dans la recherche et tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par l'Oregon Health & Science University de protection des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation.

1. Préparation chirurgicale

1. Peser la souris. La procédure décrite est réalisée sur des souris C57BL / 6 pesant entre 20 et 25 g. L'anesthésie est induite dans une boîte à induction en utilisant 3-4% d'isoflurane, et ensuite maintenu à l'aide 1.5 à 2.5% d'isoflurane dans l'air / oxygène mélange.
2. Lubrifier les yeux et la position du dos des animaux sur un coussin chauffant. Immobiliser 4 extrémités avec du ruban. Les pattes arrière-peuvent être enregistrées dans une position neutre, toutefois, les pattes doivent être fixés au plus près de la paroi thoracique que possible pour permettre une pleine excursion de la paroi thoracique au cours des compressions thoraciques.
3. Lubrifier et placer une sonde de température rectale. La température est contrôlée à l'aide d'un coussin chauffant et lampe connectée à un contrôleur de température électronique (Digi-Sense, Cole Parmer, Vernon Hills IL), qui est fixé à maintenir 37,0 ° C. Parce qu'il est possible qu'un gradient de température au sein de l'animal pourrait se développer pendant l'état d'absence de débit, il est important que la température sera mesurée et contrôlée à proximité de l'organe d'intérêt.
4. Intuber la trachée avec un 2,5 cm de calibre 22 en téflon cathéter (Insyte-W, BD, Franklin NJ) et la fin coupe distale d'un introducteur coudé (Frova Introducteur, Cook Medical, Bloomington IN). D'autres méthodes d'intubation trachéale sont acceptables, cependant, l'utilisation de l'introducteur inclinée permet un positionnement correct de la nuque dans une position légèrement étendue, ce qui optimise l'exposition chirurgicale pour le placement du cathéter intraveineux. Le cathéter endotrachéal est sécurisé par une boucle de suture à l'incisive et maintenu avec une légère tension pour immobiliser la tête pendant les compressions thoraciques.
5. Ventiler mécaniquement la souris avec un ventilateur de rongeurs mis à 140 ul, 150 respirations / minute. Ce n'est pas ajustée pour le poids que ce protocole est toujours effectué sur des animaux g 20-25. Ne pas trop approfondir l'anesthésie. Ne pas régler le ventilateur pour faire pression de fin d'expiration car cela altère la réanimation.
6. En utilisant une technique stérile et d'un microscope opératoire, placez un pré-rincé PE-10 cathéter dans la veine jugulaire. Chaque côté peut être utilisé, mais l'utilisation de la partie proche de l'opérateur réduit les risques de délogement du cathéter lors de compressions thoraciques ou autres manipulations. 0,5% bupivicaïne, 0,1 mL est infitrated en bords de la plaie pour contrôler la douleur postopératoire.
7. Fixez le PE-10 cathéter dans la fermeture de la peau avec de l'adhésif cyanoacrylate chirurgicale.
8. Placer les électrodes ECG sous-cutané et de se connecter au périphérique de contrôle. Une attention particulière à la trajectoire du signal et la maximisation du signal lui-même est essentielle à la réussite de la réanimation. S'assurer que tous les fils sont fixés à la surface d'exploitation, minimiser les passages du signal, et de minimiser les isolateurs (comme l'air dans les aiguilles creuses ou des torons) dans le trajet du signal. Aiguilles solides connecté à fil de plomb nonstranded peuvent être achetés ou fabriqués dans le laboratoire. Une fois connecté, optimiser le signal ECG sur l'écran.

2. L'arrêt cardiaque

1. Assurez-vous que la souris est normothermique, définie comme la température rectale de 36,5 ° C - 37,5 ° C. Administrer 40 ul de la température ambiante 0,5 M de chlorure de potassium par voie intraveineuse et d'observer isoélectrique traçage sur ECG. Ajustement de la dose pour le poids n'est pas nécessaire dans la fourchette 20-25 g. Démarrer minuterie d'arrêt.
2. Débranchez le ventilateur. Cesser la vapeur anesthésique. Eteignez le coussin chauffant et tout autre équipement qui produit du bruit électronique qui peut interférer avec la surveillance ECG. Placez une couverture isolante sur la souris.
3. Noter la température toutes les minutes pendant un arrêt cardiaque. Si nécessaire, une lampe de chauffage peut être utilisé pour amener la température centrale jusqu'à la plage de normothermique. Pendant un arrêt cardiaque, de préparer les fournitures et l'équipement (par exemple, la seringue d'adrénaline) pour la réanimation. Une liste de contrôle peut être utile pour assurer la réanimation sans interruption, ce qui est essentiel pour la survie.
4. Après 7 minutes, 30 secondes d'arrêt cardiaque, reconnecter le ventilateur et augmenter le taux à 180 respirations / min, en gardant le volume de marée à la mise en pré-arrêt.
5. A 8 minutes, commencer les compressions thoraciques à 300 BPM. Artefacts de mouvement sur l'ECG peut être utilisé pour juger de la RCR taux. Les compressions thoraciques doit être livré avec l'index, 5 mm au-dessus de l'appendice xiphoïde et légèrement à gauche de la ligne médiane. La poitrine doit être compressée 1.3 à 1.2 de la distance et le recul antéropostérieur complet doit être autorisé entre les compressions. Positionnement des doigts et de la pression de compression optimale sont absolument essentiels. L'incapacité d'atteindre la survie de ce modèle est presque toujours due à suboptimale RCR.
6. Infuser 0,5 ml d'épinéphrine diluée à 15 pg / ml, dans les 30 premières secondes de la RCR. Dose d'adrénaline totale est de 8-12 ug. Observer attentivement l'électrocardiogramme pour le retour à une circulation spontanée (ROSC). Narrow complexes QRS sont observées entre les artefacts de compression. RONC survient généralement entre 90 secondes et 2 minutes après le démarrage de la RCR. La réanimation est abandonnée si le ROSC ne se produit pas par 3 minutes. Fréquentes contractions ventriculaires prématurées et des changements dans l'axe ECG sont observées dans les 2 premières minutes après RONC, et presque toujours résoudre en une tachycardie sinusale stable à 2 minutes.
7. Enregistrement de temps total de la réanimation et la dose d'épinéphrine. Noter la température toutes les minutes pendant 10 minutes après RONC.
8. Conduit ECG peut être retiré lorsque la respiration spontanée débute, généralement dans les 12-15 minutes après l'RONC.
9. Extubation de la trachée lors de la fréquence respiratoire spontanée est> 60/min.
10. Placez la souris dans une cage de récupération sur une surface à température contrôlée mis à 37 ° C pour les 2 premières heures après la procédure, assurant un accès facile à la nourriture et l'eau. La cage peut alors être déplacé à la norme des conditions de logement postopératoires lorsque la souris a complètement récupéré de l'anesthésie et est actif.

3. Exsanguination / Perfusion-fixation et Harvest rein

1. 24h après CA / RCR, induire une anesthésie avec l'isoflurane 3-4% et sécuriser l'animal en décubitus dorsal sur une surface de chirurgie au sein d'une hotte qui est approprié pour une utilisation avec du formol ..
2. Approfondir l'anesthésie en augmentant progressivement la concentration de vapeurs anesthésiques à 5% et d'assurer la souris est profondément anesthésié comme en témoigne l'arrêt de la respiration spontanée.
3. Effectuer une thoracotomie preneuse et être exsangue de la souris par ponction apicale du ventricule cardiaque gauche selon les techniques standards.
4. Via la même aiguille, administrer saline à 0,9% en perfusion lente. Pour anticiper l'perfusion / exsanguination, Nick l'appendice auriculaire droit avec des ciseaux. Effectuer une laparotomie et d'observer les reins. Quand ils sont blanchis, du sérum physiologique peut être modifiée à 4% de formol pour la fixation. Les reins sont ensuite noyés dans de la paraffine et colorées avec Fluoro-Jade B pour la quantification de la nécrose épithéliale tubulaire.

4. Les résultats représentatifs:

Quand CA est induite, la pression artérielle moyenne (MAP) et le flux sanguin rénal régionales sang (RRBCF) chute à près de zéro et de rester stable jusqu'à la réanimation commence (figure 1). 24h après CA / RCR, les indices sériques de la fonction rénale (azote uréique du sang, BUN et de créatinine) sont significativement élevées par rapport à une opération fictive animaux. ASAT / ALAT sont également élevés, offrant des preuves de profonde du corps entier ischémie (figure 2). Neutrophiles gélatinase associés lipocaline (NGAL), un indicateur sensible de lésion ischémique rénale est massivement 24h surexprimés après CA / CPR (figure 3). Enfin, microphotographies montrent l'inégale, nécrose médullaire typique des lésions rénales ischémiques à l'amincissement de l'épithélium tubulaire et le remplissage luminal sur hématoxyline et éosine (Figure 4, partie A) et la mort cellulaire étendue dans l'épithélium tubulaire médullaire lors tachée de fluoro-jade B ( Figure 4, partie B).

Figure 1. L'arrêt cardiaque induit une perte instantanée de la pression de perfusion, représentée ici comme la pression artérielle moyenne (MAP), mesurée dans l'artère fémorale, résultant en quasi-complète cessation des régionales du flux sanguin rénal cortical (RRCBF) pendant toute la période d'arrêt cardiaque (ombré région). Réanimation avec des compressions thoraciques et les retours d'épinéphrine MAP à la normale et RRCBF augmente régulièrement dans la période de réanimation post. Reproduit avec la permission de ^{14 ans.}

Figure 2. 24h après l'intervention, de l'azote uréique du sang (BUN), la créatinine sérique, et l'étendue de la mort des cellules tubulaires sont tous significativement élevés chez les animaux ayant subi CA / RCP par rapport aux animaux traités avec une procédure fictive. CA / RCR induit une insulte pan-organismique ischémique, ici en évidence par l'élévation massive de la fonction hépatique des enzymes alanine aminotransférase (ALT) et d'aspartate aminotransférase (AST) en CA / RCR souris par rapport aux animaux traités imposture.

Figure 3. Western blot réalisée à l'aide d'anticorps polyclonaux de neutrophiles associée à la gélatinase lipocaline (NGAL), un indicateur sensible de lésion ischémique rénale. Les échantillons d'urine ont été obtenus immédiatement avant («pré») et 24h après ("24h") CA / RCR chez 4 animaux (étiquetés A, B, C et D ci-dessus). NGAL est massivement surexprimés chez la sourisl'urine après CA / RCR. Reproduit avec la permission de ^{14 ans.}

Figure 4. A) hématoxyline et éosine d'une section hilaire axe court de 24h tissu rénal après CA / RCR. Il ya des dommages inégaux, mais clair pour les tubules médullaires et tubulaires avec corticomédullaire brancher. Les flèches indiquent les tubules endommagé avec gonflées, des noyaux pycnotiques à la jonction cortico-médullaire. B) fluoro-jade B tache de la même région dans le même animal, 24h après CA / RCR. Taches B fluoro-jade vert vif cellules nécrotiques, montrant une nécrose parcellaire corticomédullaire tubulaire. Les flèches indiquent brillamment colorés tubules endommagé à la jonction cortico-médullaire. Ces résultats sont sensiblement similaires à résultats de la biopsie rénale chez les humains qui développent AKI, et contrairement à celles produites par d'autres modèles animaux de l'IRA.

Discussion

Le modèle normothermique d'un arrêt cardiaque et la réanimation cardio-pulmonaire chez la souris offre de multiples avenues de l'évaluation dans un modèle qui reproduit la physiopathologie et la morphologie de la cause la plus fréquente de AKI, du corps entier hypoperfusion. Test d'hypothèse peut être facilitée par l'accès à une panoplie de techniques de manipulation génétique et l'anatomie bien compris et caractérisés et la physiologie des souris de laboratoire.

Comme il...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
Chlorure de Potassium	Abbott médicale	06653-5
L'isoflurane	Abbott médicale	05260-05 (et autres)
L'épinéphrine HCl	Multiples	Multiples
Régulateur de température Digi-Sense	Cole-Palmer	EW-89000-00
Angiocath IV Cath	VWR	381134
Introducteur Frova voies angle	Cuire	G27282
Ventilateur Microvent pour souris	Harvard Apparatus	733591