Le profilage de l'expression de l'ARN de régions cérébrales murines discrètes nécessite une stratégie de collecte de tissus précise et reproductible. Un protocole utilisant à la fois la section coronale du cerveau et la microdissection assistée par un carottier tissulaire est décrit ici. Le rendement et la qualité de l'ARN total obtenu à partir des échantillons résultants confirment l'utilité de la méthode décrite.
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Article de méthode
Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l'ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d'expression génique
Dans cet article
Résumé
Résumé
En tant que plateformes technologiques, des approches telles que le séquençage de nouvelle génération, les puces à ADN et la qRT-PCR offrent un grand potentiel pour approfondir notre compréhension de l'étendue de la régulation moléculaire. De nouvelles approches, comme le séquençage de l'ARN à haute résolution (RNA-Seq)1, fournissent des informations nouvelles et étendues sur l'expression spécifique aux tissus ou aux états, telles que les niveaux relatifs de transcrits, l'épissage alternatif et les micro-ARN2-4. L'utilisation de la méthode RNA-Seq pour le profilage comparatif de l'ensemble du transcriptome5 au sein de tissus distincts ou entre des groupes d'individus phénotypiquement différents ouvre de nouvelles voies pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les états physiologiques normaux et pathologiques. Récemment, un profilage complet du transcriptome a été réalisé sur des tissus cérébraux humains, permettant d'identifier des différences d'expression génique associées à la progression de maladies6. Toutefois, l'utilisation du séquençage de nouvelle génération n'a pas encore été largement intégrée aux études chez les mammifères.
Des études d'expression génique menées sur des modèles murins ont révélé des profils distincts au sein de divers noyaux cérébraux, en utilisant la microdissection laser (LCM) pour l'excision des échantillons7,8. Bien que la LCM permette de collecter des échantillons avec une précision au niveau cellulaire unique et des régions cérébrales bien délimitées, les rendements relativement faibles en ARN total obtenus par cette méthode peuvent limiter l'utilisation du séquençage ARN (RNA-Seq) et d'autres approches de profilage dans les tissus cérébraux de souris, nécessitant parfois des étapes d'amplification sous-optimales des échantillons. Nous présentons ici un protocole de microdissection et d'extraction d'ARN total à partir de régions cérébrales murines bien définies. Des trépanes de diamètre fixe sont utilisés pour isoler 13 tissus à partir de coupes coronales sérielles de 750 µm d'un cerveau de souris individuel. Les échantillons obtenus par micropunch sont immédiatement congelés et archivés. L'ARN total est ensuite extrait à partir de ces échantillons grâce à une technologie d'isolement d'ARN total utilisant des billes magnétiques. Les échantillons d'ARN obtenus présentent un rendement et une qualité suffisants pour être utilisés dans des analyses de profilage d'expression en aval. Cette stratégie de microdissection constitue une alternative viable aux méthodes existantes de collecte d'échantillons pour l'obtention d'ARN total à partir de régions cérébrales discrètes, ouvrant la voie à de nouvelles découvertes en matière d'expression génique.
Protocole
1. Installation et préparation de l'échantillonnage
- Supplémenter la solution saline équilibrée d'Earle (EBSS) avec du bicarbonate de sodium (0,44 g par 100 mL d'EBSS) et du glucose (0,884 g par 100 mL d'EBSS)9. Traiter l'EBSS avec du DEPC (0,1 mL par 100 mL d'EBSS) pendant au moins 12 heures à 37 °C dans un flacon ou une bouteille stérilisable munie d'un bouchon à vis.
- Placer 5 pipettes Pasteur en verre de 5 ¾" dans un bécher en verre de 1000 mL, et placer des pinceaux d'artiste, les poils orientés vers le haut, dans un cylindre gradué en verre de 100 mL. Ajouter une quantité suffisante de solution de DEPC (0,1 mL par 100 mL d'eau ddH2O) pour recouvrir respectivement les pipettes et les pinceaux. Couvrir le bécher et le cylindre gradué avec du papier d'aluminium, puis incuber pendant au moins 12 heures à 37 °C.
- Après une incubation de 12 heures avec le DEPC, chauffer tous les matériaux traités au DEPC à une température >100 °C pendant au moins 15 minutes. Retirer l'EBSS et le laisser refroidir à température ambiante avant de le stocker à 4 °C. Verser l'eau ddH2O hors du bécher et du cylindre gradué ; poursuivre l'incubation à >100 °C jusqu'à ce que les matériaux soient secs. Retirer, laisser refroidir à température ambiante, puis stocker pour une utilisation ultérieure.
- Le jour de l'expérience, traiter toutes les surfaces de travail avec du RNaseZap.
- Placer et maintenir l'EBSS dans un bain-marie réglé à 40 °C. Pour tamponner et oxygéner l'EBSS, insuffler un mélange 95 %/5 % O2/CO2 en introduisant un tube à gaz dans une pipette Pasteur sans RNase et en plongeant la pipette dans l'EBSS. Couvrir l'ouverture du récipient contenant l'EBSS.
- Préparer un coupe-tissu Stoelting pour la sectionnement en série du tissu cérébral. Traiter les surfaces supérieure et inférieure du coupe-tissu avec du RNaseZap. Fixer un morceau rectangulaire de papier filtre Whatman n°4 sur la surface en plexiglas du coupe-tissu. Fixer une lame de rasoir double tranchant au bras du coupe-tissu. Régler le micromètre à zéro et ajuster la hauteur minimale du bras du coupe-tissu de manière à ce que la lame coupe le papier filtre sans endommager la plaque de plexiglas.
- Rassembler tous les autres matériaux nécessaires à la microdissection, notamment des boîtes de culture cellulaire de 60x15 mm sans RNase, des carottiers tissulaires Harris Uni-Core, des pointes de micropipette sans RNase de 200 μL destinées à être fixées sur des tubes à gaz pour l'oxygénation de sections coronales cérébrales dans l'EBSS pendant le prélèvement de microéchantillons, des ciseaux courbes, de la neige carbonique et des tubes pour la collecte des tissus. Placer les tubes sur de la neige carbonique.
2. Retrait du cerveau et découpage en sections coronales
- Placer la souris dans un cône de découpage (DecapiCone) et la décapiter à l’aide d’une guillotine pour rongeur. Retirer la tête du cône et la placer sur une surface plane. À l’aide d’un scalpel, inciser la peau en ligne médiane du crâne en partant d’environ 3 mm en arrière des narines. Replier latéralement les lambeaux de peau afin d’exposer le crâne et les orbites oculaires.
- À l’aide de ciseaux courbes, sectionner les deux nerfs optiques pour les détacher de l’œil. Ouvrir la cavité crânienne en brisant soigneusement les os occipital et interpariétal et en retirant les os pariétaux dorsaux et frontal. À l’aide d’un rongeur, briser les os nasaux et lacrymaux afin d’exposer les bulbes olfactifs. Utiliser les ciseaux courbes pour détacher les bulbes olfactifs de la partie antérieure du cerveau. Retirer l’ensemble du cerveau en conservant l’encéphale postérieur. Placer le cerveau dans la partie supérieure d’une boîte de culture cellulaire Cellstar de 60 x 15 mm, exempte de RNase. Transférer sur la surface de travail dédiée à l’échantillonnage tissulaire.
- Utiliser une pipette exempte de RNase pour humidifier modérément le papier filtre fixé au coupe-tissus avec du EBSS. Mouiller le tissu cérébral avec du EBSS.
- Transférer le cerveau sur le coupe-tissus et l’orienter correctement. Remarque : le cerveau doit être positionné avec sa face ventrale posée sur le papier filtre. La ligne médiane (fissure interhémisphérique) doit être perpendiculaire à la lame du coupe-tissus, et le bord rostral du cerveau doit être en contact avec la lame.
- Utiliser un pinceau d’artiste traité au DEPC pour maintenir le cerveau immobile en exerçant une pression douce sur sa face dorsale. En maintenant le cerveau immobile, soulever le levier du support de lame d’environ 4 à 5 cm au-dessus de la surface tissulaire dorsale et le maintenir dans cette position. Retirer le pinceau de la surface du cerveau, puis régler le micromètre sur 750 μm. Lâcher le levier, ce qui abaisse la lame et sectionne le tissu, produisant une coupe coronale de 750 μm.
- Tandis que la lame du coupe-tissus reste immobile, utiliser un mouvement de roulement avec le pinceau pour déplacer délicatement la section tissulaire loin de la surface de la lame. Placer immédiatement la section tissulaire dans le EBSS oxygéné contenu dans la boîte de Pétri. Un deuxième expérimentateur peut commencer l’étape 3.1.
- Répéter les étapes 2.5 et 2.6 jusqu’à obtention de sections cérébrales en série couvrant tout le plan rostro-caudal.
3. Microdissection de régions cérébrales
- Régler l'éclairage afin de garantir que l'illumination de l'échantillon ne sera pas obstruée pendant la microdissection tissulaire. Ajuster la position et le débit du mélange 95 %/5 % de O2/CO2 pour maintenir un environnement tamponné et oxygéné pour le tissu durant la microdissection.
- Identifier la coupe cérébrale coronale incluant la région d'intérêt. Orienter la coupe cérébrale à plat sur le fond de la boîte de Pétri à l’aide d’un pinceau d’artiste. Choisir le carottier tissulaire de diamètre approprié selon le Tableau 1 ou d'autres références. Tout en maintenant la coupe tissulaire coronale en place avec le pinceau d’artiste, abaisser l’embout de découpe du carottier tissulaire sur la surface de la coupe tissulaire.
- En exerçant une pression, enfoncer fermement l’embout du carottier tissulaire à travers la coupe tissulaire jusqu’au fond de la boîte de Pétri. Utiliser un mouvement circulaire roulant pour s’assurer que la région d’intérêt a été dissociée du tissu environnant. Soulever délicatement le carottier tissulaire loin de la coupe tissulaire et libérer le micropunch, en permettant à celui-ci de flotter dans l’EBSS.
- À l’aide d’un pinceau d’artiste, déposer immédiatement le micropunch tissulaire dans un tube de stockage stable à -80 °C placé sur de la glace sèche. Le tissu doit adhérer facilement à la paroi du tube. Replacer le tube contenant le microéchantillon sur la glace sèche.
- Répéter les étapes 3.2 à 3.4 pour chaque région cérébrale d’intérêt.
4. Archivage des tissus
- Une fois la microdissection terminée, utilisez le système de numérisation VisionMate pour enregistrer les codes-barres respectifs de chaque tube TrakMates contenant un échantillon. Dès que la boîte TrakMates de 96 emplacements est remplie, numérisez rapidement la boîte puis placez immédiatement les échantillons de tissu dans un congélateur à -80 °C jusqu'à l'extraction de l'ARN.
5. Extraction d'ARN total
- Préparez un espace de travail exempt de RNase à l'aide de RNaseZap. Préparez une quantité suffisante de mélange de billes magnétiques et de solution de lyse/fixation selon les instructions décrites dans le protocole d'isolement d'ARN total MagMAX-9610.
- Retirez les échantillons de tissu du congélateur à -80 °C et placez immédiatement les tubes sur de la glace sèche.
- Ajoutez 100 μL de la solution de lyse/fixation à un tube TrakMates contenant un échantillon. Fixez un pilon sans nucléase de taille adaptée à un tube de 0,5 ml sur le mélangeur de pastilles et homogénéisez le tissu. À l’aide d’une pipette sans nucléase à faible rétention, transférez l’échantillon homogénéisé dans un puits d’une plaque de culture cellulaire ronde à 96 puits. Ajoutez immédiatement 60 μL d’isopropanol à 100 % à l’aide d’une pipette sans nucléase à faible rétention, puis mélangez en aspirant et en expulsant 3 à 4 fois.
- Ajoutez 20 μL du mélange de billes à l’échantillon à l’aide d’une pipette sans nucléase à faible rétention. Mélangez en aspirant et en expulsant 3 à 4 fois.
- Répétez les étapes 5.3 à 5.4 pour tous les échantillons de tissu.
- Suivez les étapes du protocole d’isolement d’ARN total MagMAX-96 à partir du point III.A.2 pour terminer l’extraction d’ARN total. REMARQUE : D'autres kits d'isolement d'ARN total utilisant des billes magnétiques sont disponibles commercialement ; toutefois, ils n'ont pas été évalués dans cette étude. Veuillez consulter les manuels fournis par les fabricants pour les détails relatifs à l'isolement d'ARN total avec les produits respectifs.
- Évaluez la pureté et la concentration de l’ARN total obtenu à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop 3300 ou d’autres technologies de spectrophotométrie/fluorométrie à faible volume.
6. Résultats représentatifs :
| Région cérébrale/Noyau | Diamètre du carottier tissulaire (mm) | ARN total (ng/μL) | Ratio 260/280 |
| Cortex frontal | 2,0 | 27,03 | 1,99 |
| Noyau accumbens | 1,0 | 6,26 | 2,77 |
| Striatum | 1,5 | 27,94 | 2,19 |
| Cortex cingulaire | 1,5 | 29,05 | 2,07 |
| Hypothalamus - Noyau paraventriculaire / Noyau suprachiasmatique (PVN/SCN) | 2,0 | 40,34 | 2,03 |
| Thalamus | 2,0 | 34,40 | 2,00 |
| Hypothalamus - Noyau dorsomédian / Noyau ventromédian (DMH/VMH) | 2,0 | 44,83 | 2,05 |
| Amygdale | 1,0 | 10,06 | 1,89 |
| Hippocampe - CA 2/3 | 1,5 | 7,31 | 2,32 |
| Hippocampe - CA1/Gyrus denté | 1,5 | 5,20 | 2,24 |
| Grise périventriculaire | 1,0 | 48,21 | 2,02 |
| Noyau du raphé dorsal | 1,0 | 6,56 | 2,18 |
| Formation réticulée | 2,0 | 35,35 | 2,27 |
Tableau 1. Énumération des régions cérébrales de souris microdisséquées avec les diamètres optimaux respectifs du carottier tissulaire, le rendement total en ARN représentatif et la pureté. Les 13 régions cérébrales microdisséquées, énumérées en ordre rostro-caudal, varient en taille et en orientation. Le prélèvement au micropoinçon de la PVN/SCN inclut le noyau paraventriculaire antéromédial, des portions du noyau périventriculaire, la zone sous-paraventriculaire et d'autres neurones parvocellulaires. Le prélèvement au micropoinçon du thalamus inclut les noyaux thalamiques antérieurs situés dans le même plan coronal que la région du prélèvement de la PVN/SCN. Le prélèvement au micropoinçon du DMH/VMH inclut les noyaux magnocellulaires accessoires et d'autres neurones parvocellulaires situés entre le noyau dorsomédial et le noyau ventromédial. L'échantillon d'amygdale inclut les sous-régions centrale et basolatérale. Le rendement en ARN et les rapports 260/280 sont des valeurs uniques obtenues à partir d'échantillons respectifs de microdissection afin de démontrer les mesures obtenues pour chaque région cérébrale.
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Discussion
Il existe de nombreuses étapes critiques dans ce protocole qui nécessitent une attention et une réflexion attentives. Le choix du diamètre approprié du carottier tissulaire doit être déterminé en fonction du prélèvement de chaque région d'intérêt respective. Bien que les diamètres de carottier tissulaire indiqués dans le tableau 1 soient adaptés à la collecte des régions cérébrales énumérées, chaque chercheur doit déterminer le diamètre de carottier le plus approprié pour une collecte optimale de son (ses) tissu(s) d'int...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêts déclaré.
Remerciements
Ce travail a été financé par l'Agence de projets de recherche avancée en défense (Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA) et le Bureau de recherche de l'armée (Army Research Office, ARO), numéro de subvention W911NF-10-1-006.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bain-marie Isotemp 102 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| Agitateur rotatif de laboratoire (agitateur orbital) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| Agitateur de centrifugation | VWR international | 47747-370 | |
| Pestel de 0,5 mL sans RNase | VWR international | KT749521-0590 | Sans nucléase |
| Diéthylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| Lames de rasoir à double tranchant | Stoelting Co. | 51427 | |
| Coupe-tissus St–lting avec micromètre manuel | Stoelting Co. | 51425 | |
| Pinceau rond 2/0 pour artiste’s | Princeton Art Brush | 4350R | |
| Carottier tissulaire Harris Uni-Core (0,75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Carottier tissulaire Harris Uni-Core (1,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Carottier tissulaire Harris Uni-Core (1,5 mm) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Carottier tissulaire Harris Uni-Core (2,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| Guillotine | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| DecapiCones | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| Solution saline équilibrée d'Earle’s (EBSS) HyClone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| Pipettes de 25 mL | Corning | 4489 | Sans nucléase |
| Pointes de pipette epT.I.P.S. LoRetention Dualfilter, 20 — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| Tubes à visser TrakMates avec bouchons | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| Lecteur sans fil de codes-barres 2D VisionMate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| Lecteur de codes-barres 2D VisionMate SR avec support simple | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| Pointes de pipette universelles 1-200 μL | Corning | 4864 | Sans nucléase |
| Plaques de culture cellulaire Cellstar | Greiner Bio-One | 628160 | Sans nucléase |
| Plaque de culture tissulaire en polystyrène 96 puits Cellstar de Greiner Bio-One, fond U | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | Sans nucléase |
| Papier filtre #4 | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| Pompe à pipeter de sécurité à bulbe en silicone | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| Spectrophotomètre NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Références
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- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
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Réimpressions et autorisations
