Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l'ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d'expression génique

Résumé

Le profilage de l’expression de l’ARN de régions cérébrales discrètes de souris nécessite une stratégie de collecte de tissus précise et reproductible. Un protocole qui utilise à la fois la section coronale du cerveau et la microdissection assistée par carottage tissulaire est décrit ici. Le rendement et la qualité de l’ARN total obtenu à partir des échantillons résultants confirment l’utilité de la méthode décrite.

Résumé

En tant que plateformes technologiques, des approches telles que le séquençage de nouvelle génération, les microréseaux et la qRT-PCR sont très prometteuses pour élargir notre compréhension de l’étendue de la régulation moléculaire. De nouvelles approches telles que le séquençage de l’ARN à haute résolution (RNA-Seq)¹ fournissent des informations nouvelles et étendues sur l’expression spécifique à un tissu ou à un état, telles que les niveaux relatifs de transcrits, l’épissage alternatif et les micro-ARN^2-4. Les perspectives d’utilisation de la méthode RNA-Seq dans le profilage comparatif du transcriptome entier⁵ au sein de tissus discrets ou entre des groupes d’individus phénotypiquement distincts offrent de nouvelles voies pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les états physiologiques normaux et anormaux. Récemment, un profilage du transcriptome entier a été effectué sur du tissu cérébral humain, identifiant des différences d’expression génique associées à la progression de la maladie⁶. Cependant, l’utilisation du séquençage de nouvelle génération n’a pas encore été plus largement intégrée dans les études sur les mammifères.

Des études d’expression génique dans des modèles murins ont rapporté des profils distincts au sein de divers noyaux cérébraux à l’aide de la microscopie à capture laser (LCM) pour l’excision d’échantillons^7,8. Bien que le LCM permette de collecter des échantillons avec une précision à l’échelle d’une seule cellule et d’une région cérébrale discrète, les rendements totaux en ARN relativement faibles de l’approche LCM peuvent être prohibitifs pour le RNA-Seq et d’autres approches de profilage dans les tissus cérébraux de souris et peuvent nécessiter des étapes d’amplification d’échantillon sous-optimales. Ici, un protocole est présenté pour la microdissection et l’extraction totale de l’ARN à partir de régions cérébrales discrètes de souris. Les carottiers tissulaires de diamètre défini sont utilisés pour isoler 13 tissus à partir de coupes coronales en série de 750 μm du cerveau d’une souris individuelle. Les échantillons de tissus sont immédiatement congelés et archivés. L’ARN total est obtenu à partir des échantillons à l’aide de la technologie d’isolement de l’ARN total activée par des billes magnétiques. Les échantillons d’ARN qui en résultent ont un rendement et une qualité adéquats pour être utilisés dans le profilage d’expression en aval. Cette stratégie de microdissection offre une option viable aux stratégies existantes de collecte d’échantillons pour obtenir de l’ARN total à partir de régions cérébrales discrètes, ouvrant ainsi des possibilités pour de nouvelles découvertes sur l’expression génique.

Protocole

1. Configuration et préparation de l’échantillonnage

1. Complétez la solution saline équilibrée d’Earle avec du bicarbonate de sodium (0,44 g par 100 ml d’EBSS) et du glucose (0,884 g par 100 ml d’EBSS)⁹. Traiter l’EBSS avec du DEPC (0,1 mL par 100 mL d’EBSS) pendant au moins 12 heures à 37 °C dans un flacon autoclavable ou une fiole munie d’un bouchon à vis.
2. Placez des pipettes Pasteur en verre de 5 3/4 po dans un bécher en verre de 1000 ml et placez les pinceaux d’artiste, avec les poils vers le haut, dans un cylindre gradué en verre de 100 ml. Ajouter suffisamment de solution de DEPC (0,1 mL par 100 mL de ddH₂O) pour couvrir les pipettes et les brosses, respectivement. Couvrez le bécher et le cylindre gradué d’une feuille d’aluminium et incubez pendant au moins 12 heures à 37 °C.
3. Après une incubation de 12 heures avec du DEPC, chauffer tous les matériaux traités au DEPC à une température de >100 °C pendant au moins 15 minutes. Retirer l’EBSS et laisser refroidir à température ambiante avant de l’entreposer à 4 °C. Verser le jdH₂O loin du bécher et du cylindre gradué ; continuer à incuber à >100 °C jusqu’à ce que les matériaux soient secs. Retirer, laisser refroidir à température ambiante et conserver pour une utilisation ultérieure.
4. Le jour de l’expérience, traitez toutes les surfaces de travail avec RNaseZap.
5. Placez et maintenez EBSS dans un bain-marie réglé à 40 °C. Pour tamponner et oxygéner l’EBSS, infiltrez-le avec 95 %/5 % d’O₂/CO₂ en plaçant le tube de gaz dans une pipette Pasteur sans RNase et en insérant la pipette dans l’EBSS. Couvrir l’ouverture du conteneur EBSS.
6. Installez une trancheuse de tissus Stoelting pour une utilisation dans la section en série du tissu cérébral. Traitez les surfaces supérieure et inférieure de la trancheuse de tissus avec RNaseZap. Fixez un morceau rectangulaire de papier filtre Whatman #4 sur la surface en plexiglas du hachoir à tissus. Fixez une lame de rasoir à double tranchant au bras de l’hélicoptère. Réglez le micromètre sur zéro et ajustez la hauteur minimale du bras du hachoir pour permettre à la lame de rasoir de couper le papier filtre, mais pas la plaque de plexi-verre.
7. Rassemblez tous les matériaux supplémentaires nécessaires à la microdissection, y compris des boîtes de culture cellulaire 60 x 15 mm sans RNase, des carotteurs de tissus Harris Uni-Core, des pointes de micropipette sans RNase de 200 μL pour la fixation sur un tube de gaz pour l’oxygénation EBSS des sections cérébrales coronales pendant le poinçonnage de microéchantillons, des ciseaux incurvés, de la glace sèche et des tubes pour le prélèvement de tissus. Placez les tubes sur de la glace sèche.

2. Ablation du cerveau et section coronale

1. Placez la souris dans un DecapiCone et décapitez-la à l’aide d’une guillotine pour rongeurs. Retirez la tête du DecapiCone et placez-la sur une surface plane. À l’aide d’un scalpel, coupez la peau le long de la ligne médiane du crâne en commençant par la caudale d’environ 3 mm jusqu’à la narine. Décollez latéralement les lambeaux cutanés pour exposer le crâne et les orbites.
2. À l’aide de ciseaux incurvés, coupez les deux nerfs optiques, coupant leur connexion à l’œil. Ouvrez la cavité crânienne en brisant soigneusement les os occipitaux et interpariétaux et en enlevant les os dorsaux, pariétaux et frontaux. À l’aide d’un rongeur d’os, cassez les os nasaux et lacrymaux pour exposer les bulbes olfactifs. Utilisez des ciseaux incurvés pour couper les bulbes olfactifs loin du cerveau rostral. Retirez tout le cerveau avec le cerveau postérieur intact. Placez le cerveau dans le haut d’une boîte de culture cellulaire Cellstar de 60 x 15 mm, sans RNase. Transfert sur la surface de travail de l’échantillonnage des tissus.
3. À l’aide d’une pipette sans RNase, humidifiez doucement le papier filtre jusqu’au hachoir à tissus attaché avec EBSS. Mouillez le tissu cérébral avec EBSS.
4. Transférez le cerveau dans le hachoir à tissus et établissez l’orientation appropriée. Remarque : Le cerveau doit être positionné avec la surface ventrale reposant sur le papier filtre. La ligne médiane (fissure interhémisphérique) doit être perpendiculaire à la lame de l’hélicoptère, et le bord rostral du cerveau doit buter la lame.
5. Utilisez un pinceau d’artiste traité au DEPC pour maintenir le cerveau immobile en appliquant une légère pression sur la surface dorsale du cerveau. Tout en maintenant le cerveau immobile, soulevez le levier du porte-lame à environ 4-5 cm au-dessus de la surface du tissu dorsal et maintenez-le dans cette position. Retirez la brosse de la surface du cerveau et composez 750 μm à l’aide du micromètre. Laissez tomber le levier, hachant le tissu et créant une section coronale de 750 μm.
6. Pendant que la lame du hachoir reste immobile, utilisez un mouvement de roulement avec le pinceau d’artiste pour balayer doucement la section de tissu loin de la surface de la lame. Placez immédiatement la section de tissu dans l’EBSS oxygéné dans la boîte de Pétri. Un deuxième enquêteur peut commencer à l’étape 3.1.
7. Répétez les étapes 2.5 et 2.6 jusqu’à ce que des coupes cérébrales en série aient été obtenues sur l’ensemble du plan rostro-caudal.

3. Microdissection de la région du cerveau

1. Ajustez l’éclairage pour vous assurer que l’éclairage de l’échantillon ne sera pas obstrué pendant la microdissection tissulaire. Ajustez la position et le débit du mélange 95 %/5 % d’O₂/CO₂ pour maintenir un environnement tamponné et oxygéné pour le tissu pendant la microdissection.
2. Identifiez la section du cerveau coronal qui comprend la région d’intérêt. Orientez la section du cerveau à plat au fond de la boîte de Pétri à l’aide d’un pinceau d’artiste. Sélectionnez le carottier de tissu avec le diamètre approprié en fonction du tableau 1 ou d’autres références. Tout en maintenant la section de tissu coronaire en place avec le pinceau d’artiste, amenez la pointe de coupe du carotier de tissu sur la surface de la section de tissu.
3. Tout en appliquant une pression, appuyez fermement sur l’extrémité du vide-tissu à travers la section du tissu et descendez fermement sur le fond de la boîte de Pétri. Utilisez un mouvement circulaire de roulement pour vous assurer que la région d’intérêt a été dissociée du tissu environnant. Soulevez délicatement le carotier de tissu de la section de tissu et libérez le micropunch, lui permettant de flotter dans l’EBSS.
4. À l’aide d’un pinceau d’artiste, déposez immédiatement le micropunch en tissu dans un tube de stockage stable à -80 °C conservé sur de la glace sèche. Le tissu doit facilement adhérer au côté du tube. Remettez le tube contenant le microéchantillon dans la glace sèche.
5. Répétez les étapes 3.2 à 3.4 pour chaque région cérébrale d’intérêt.

4. Archivage des tissus

1. Une fois la microdissection terminée, utilisez le système de scanner VisionMate pour enregistrer les codes-barres respectifs de chaque tube TrakMates contenant un échantillon. Une fois que le support de tubes TrakMates à 96 emplacements a été rempli, scannez rapidement le support et placez immédiatement les échantillons de tissus dans un congélateur à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN.

5. Extraction de l’ARN total

1. Préparez un espace de travail sans RNase à l’aide de RNaseZap. Préparez une quantité suffisante de mélange de billes magnétiques et de solution de lyse/liaison comme décrit dans le protocole d’isolement de l’ARN total MagMAX-96¹⁰.
2. Retirez les échantillons de tissus du congélateur à -80 °C et placez les tubes directement sur la glace sèche.
3. Ajouter 100 μL de la solution de lyse/liaison dans un tube TrakMates contenant un échantillon. Fixez un pilon de la taille d’un tube de 0,5 ml sans nucléase au mélangeur de granulés et homogénéisez le tissu. À l’aide d’une pointe de pipette sans nucléase à faible rétention, transférez l’échantillon homogénéisé dans un puits sur une plaque de culture tissulaire à fond rond de 96 puits. Ajouter immédiatement 60 μL d’isopropanol à 100 % à l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette sans nucléase à faible rétention, et mélanger en pipetant de haut en bas 3 à 4 fois.
4. Ajoutez 20 μL du mélange de billes à l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette sans nucléase à faible rétention. Mélanger en pipetant de haut en bas 3-4 fois.
5. Répétez les étapes 5.3 et 5.4 pour tous les échantillons de tissus.
6. Suivez les étapes du protocole d’isolement de l’ARN total MagMAX-96 à partir de III.A.2 pour terminer l’extraction de l’ARN total. note: D’autres kits d’isolement d’ARN total à billes magnétiques sont disponibles dans le commerce ; Cependant, ils n’ont pas été examinés dans la présente étude. Veuillez vous référer aux manuels du kit du fabricant pour plus de détails sur l’isolement total de l’ARN à l’aide des produits respectifs.
7. Mesurez la pureté et la concentration de l’ARN total résultant à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop 3300 ou d’autres technologies de spectrophotomètre/fluorimètre à petit volume.

6. Résultats représentatifs :

Région/noyau du cerveau	Diamètre du videur de tissu (mm)	ARN total (ng/μL)	Rapport 260/280
Cortex frontal	2,0	27.03	1,99
Noyau Accumbens	1.0	6.26	2,77
Striatum	1.5	27,94	2.19
Cortex cingulaire	1.5	29.05	2,07
Hypothalamus - Noyau paraventriculaire / Noyau suprachiasmatique (PVN/SCN)	2,0	40,34	2,03
thalamus	2,0	34,40	2,00
Hypothalamus - Noyau dorsomédial / Noyau ventromédial (DMH/VMH)	2,0	44,83	2,05
amygdale	1.0	10.06	1,89
Hippocampe - Ca 2/3	1.5	7,31	2,32
Hippocampe - Ca1/Gyrus denté	1.5	5.20	2,24
Périaqueductal Gris	1.0	48,21	2,02
Noyau du raphé dorsal	1.0	6,56	2,18
Formation réticulaire	2,0	35.35	2,27

Table 1. Dénombrement de régions cérébrales de souris microdisséquées avec des diamètres de carottage tissulaire optimaux respectifs, un rendement total représentatif en ARN et une pureté. Les 13 régions cérébrales microdisséquées, répertoriées dans l’ordre rostro-caudal, varient en taille et en orientation. Le micropoinçon PVN/SCN comprend le noyau paraventriculaire antéromédial, des parties du noyau périventriculaire, la zone sous-paraventriculaire et d’autres neurones parvocellulaires. Le micropoinçon du thalamus comprend des noyaux thalamiques antérieurs situés dans le même plan coronal que la région du micropoinçon PVN/SCN. Le micropoinçon DMH/VMH comprend des noyaux magnocellulaires accessoires et d’autres neurones parvocellulaires situés entre le noyau dorsomédial et le noyau ventromédial. L’échantillon d’amygdale comprend à la fois les sous-régions centrale et basolatérale. Le rendement en ARN et les rapports 260/280 sont des valeurs uniques obtenues à partir d’échantillons de microdissection respectifs pour démontrer les lectures obtenues dans chaque région du cerveau.

Discussion

De nombreuses étapes cruciales de ce protocole méritent une attention et une considération particulières. Le choix du diamètre approprié du carottier tissulaire doit être déterminé pour éliminer chaque région d’intérêt respective. Bien que les diamètres des carottiers tissulaires présentés dans le tableau 1 conviennent à la collecte des régions cérébrales énumérées, chaque chercheur doit déterminer le carottier tissulaire de taille appropriée pour une collecte optimale de son ou ses tissus d’intérêt respectifs. Deuxiè...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bain-marie Isotemp 102	Fisher Scientific	15-460-3Q
RNase Zap	Ambion	AM9782
Rotateur de laboratoire (agitateur orbital)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314 – ;- 1CEQ
Mélangeur à granulés	VWR international	47747-370
Pilon sans RNase 0,5 mL	VWR international	KT749521-0590	sans nucléase
(DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758-50ML
Lames de rasoir à double tranchant	Stoelting Co.	51427
RUE– ; Trancheuse de tissus avec micromètre manuel	Stoelting Co.	51425
2/0 Rond artiste' s pinceau Princeton	Art Brush	4350R
Harris Uni-Core carotier (0,75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Vide-tissu Harris Uni-Core (1,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15099
Corottier à tissus Harris Uni-Core (1,5 mm)	Ted Pella, Inc.	15075
Carotteur de tissu Harris Uni-Core (2,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15076
Guillotine	Braintree Scientific, Inc.	RG-100
DecapiCones	Braintree Scientific, Inc.	MDC-200
HyClone Earle' s solution saline équilibrée (EBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30029.02
Pipettes de 25 mL	Corning	4489
EPi.P.S. sans nucléases LoRetention Pointes de pipette à double filtre, 20 &mdash ; 300 &mu ; L	Eppendorf	0030 077.636
TrakMates tubes à vis avec bouchons	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3741
Lecteur de codes-barres 2D sans fil VisionMate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3122MTX
VisionMate SR lecteur de codes-barres 2D à rack unique	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3115
1-200 &mu ; L embouts de pipette universels	Corning	4864
culture cellulaire Cellstar	nucléases	Greiner Bio-One	628160
Plaque de culture tissulaire en polystyrène 96 puits Greiner Bio-One 96 puits, U-bottom	USA Scientific, Inc.	5665-0180	Papier filtre sans nucléase
#4	Whatman, GE Healthcare	1004 150
Remplisseuse de pipette de sécurité à bulbe en silicone	Fisher Scientific	13-681-102A
Spectrophotomètre NanoDrop 3300	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-3300