T CD4 + des lymphocytes capturer en utilisant une puce jetable microfluidiques pour le VIH

Protocole

1. Préparer canal microfluidique avec des anti-CD4 ⁺ de surface biotinlayted.
2. Injecter 10 ml de l'échantillon sanguin à 5 ml / min dans le canal microfluidique avec pompe seringue.
3. Rincer le sang à 20 ml / min pendant 20 min avec du PBS.
4. Injecter une solution diluée d'FACS lyse (dilué à 10% de la solution stock avec PBS) à 5ul/min pendant 15 min.
5. Incuber pendant 15 min.
6. Injecter CD3 ⁺ solution d'anticorps primaire (dilué à 10% de solution stock avec du PBS) à 5 ml / min pendant 20 min.
7. Incuber pendant 2 heures.
8. Rincer le canal avec du PBS à 5 ml / min pendant 15 min.
9. Injecter 20% AF488 CD4 ^+, 0,2% d'une solution stock de DAPI, et 10% CD3 ⁺ anticorps secondaires à 5 ml / min pendant 20 min dans le même temps.
10. Incuber pendant 20 min.
11. Rincer le canal avec du PBS à 5 ml / min pendant 15 min.
12. Comptez cellules sous microscope à fluorescence:
    1. Blanc (optique) - Noir et blanc: la cellule et de la poussière
    2. UV (DAPI) - Bleu: seule cellule
    3. Bleu (CD4 ⁺⁾ - Vert: des lymphocytes T et des monocytes
    4. Green (CD3 ⁺⁾ - Rouge: les lymphocytes T ne

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microcanal en PDMS				Fabriqué à l’aide d’un moule en SU-8
Sang				Sang provenant de donneurs humains sains. Mass General Hospital, 10 X leucocytes à haute densité ou Brigham and Women’s Hospital.
PBS	Tampon	Invitrogen	14190	Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco’s à 1x.
Solution de lyse FACS		BD Biosciences	349202	Diluée à 10 % à partir de la solution mère avec du PBS.
Ac anti-CD4+ biotinylé		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Surface préparée avec un Ac anti-CD4+ biotinylé, dilué à 10 % à partir de la solution mère avec du PBS/BSA après mélange de 0,2 mg de solution mère et de 1 ml d’eau déionisée.
Ac polyclonal caprin anti-hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Dilué à 10 % à partir de la solution mère avec du PBS
Ac secondaire IgG caprine anti-caprine marqué PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Ac secondaire pour l’Ac anti-CD3, dilué à 10 % à partir de la solution mère avec du PBS
Ac anti-CD4+ humain		BD Biosciences	557695	Marqué avec Alexa Fluor 488, dilué à 20 % à partir de la solution mère avec du PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	Solution de 4’,6-dianidino-2-phénylindole, dihydrochlorure, diluée à 0,2 % à partir de la solution mère avec du PBS.