Titre encapsulation cellulaire par des gouttelettes

Protocole

NIH3T3 la préparation des cellules:

A. Cellules pour l'éjection

1. Trypsiniser cellules, puis diluer 1:1 avec les médias de cellules, et le transfert à partir d'un flacon T75 à un tube Falcon de 15 ml
2. Isoler les cellules en un culot par centrifugation, aspirer le surnageant et laver les cellules avec du DPBS
3. Isoler les cellules en un culot à nouveau, et aspirer le surnageant
4. Resuspendre les cellules dans les médias
5. Déterminer la densité des cellules avec des hémocytomètre (~ 200 x 10 ⁴ cellules / mL par flacon T75)
6. Solution cellulaire Centrifuger, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans le montant approprié des médias pour différentes concentrations cellulaires

Cellule d'éjection B.

1. Cellules Vortex avant de l'utiliser pour l'éjection
2. Transférer 200 ul de solution de la cellule dans la seringue
3. Réglez le mode approprié sur un générateur d'impulsions
   1. Pour éjecter des gouttelettes d'unique et de multiples gouttelettes (rafales), mis en générateur d'impulsions à «E. BUR" mode
   2. Pour l'éjection de gouttelettes en continu, mis en générateur d'impulsions à "NORM" mode
4. Modifier les paramètres du signal
   1. Réglez le niveau de haute et basse tension de sortie niveau: HIL à 5 V et de LOL à 0 V et assurez-vous de la «LIM» est allumée
   2. Régler le signal comme un signal carré
   3. Changer la quantité de temps l'électrovanne est ouverte pour l'éjection de gouttelettes en changeant la valeur de "IFD" ou le changement cyclique («devoir»)
   4. Modifier la fréquence d'éjection en changeant la valeur de "PER"
   5. Modifier le nombre de gouttelettes éjectées dans un élan en changeant la valeur de "BUR"
5. Solution cellulaire éjection sur le substrat préparé pour l'imagerie au microscope

Coloration C.

1. Maquillage solution de colorant avec 0,5 uL calcéine-AM et 2 uL d'éthidium homodimère par ml de DPBS
2. Plongez substrat préparé dans une solution de teinture
3. Laisser l'échantillon à incuber pendant 10 minutes à 37 ° C avant d'imagerie

Validation Experiment

1. Sur un Nikon Eclipse TE-2000 U microscope à fluorescence
   1. Logiciels avancés spot (Diagnostics, Inc)
   2. Live / Dead Assay

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope fluorescent		Nikon Instruments	Eclipse TE-2000 U
Éjecteur de cellules à valve solénoïde				Fréquence de fonctionnement : 1 kHz, 30 psi, 50 nl~0,5 µl. Pilote de valve 12 V : courant de commande 2,5 A
Réservoir d'air portable de 5 gallons		Coleman	Powermate CT5	Pression d'air : 30 psi
Régulateurs de pression		Marsh Bellofram
Générateur d'impulsions			HP8112A	Génération de fréquence d'activation : 50 MHz
Plateau XYZ		Newmark Systems		Avec moteur pas à pas : plateau XY course 6 pouces (NLS4-6-25), plateau Z course 2,5 pouces (NLS4-2,5-25), contrôleur 3 axes (NSC-G3), résolution 0,1 µm
NIH 3T3	Ligne cellulaire			fibroblastes
Trypsine				Solution à 0,05 %
Milieu pour cellules NIH 3T3
DPBS	tampon
T75				Flacons de culture tissulaire
Tubes coniques en plastique				15 ml, pour culture tissulaire