Titre encapsulation cellulaire par des gouttelettes

Protocol

NIH3T3 la préparation des cellules:

A. Cellules pour l'éjection

1. Trypsiniser cellules, puis diluer 1:1 avec les médias de cellules, et le transfert à partir d'un flacon T75 à un tube Falcon de 15 ml
2. Isoler les cellules en un culot par centrifugation, aspirer le surnageant et laver les cellules avec du DPBS
3. Isoler les cellules en un culot à nouveau, et aspirer le surnageant
4. Resuspendre les cellules dans les médias
5. Déterminer la densité des cellules avec des hémocytomètre (~ 200 x 10 ⁴ cellules / mL par flacon T75)
6. Solution cellulaire Centrifuger, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans le montant approprié des médias pour différentes concentrations cellulaires

Cellule d'éjection B.

1. Cellules Vortex avant de l'utiliser pour l'éjection
2. Transférer 200 ul de solution de la cellule dans la seringue
3. Réglez le mode approprié sur un générateur d'impulsions
   1. Pour éjecter des gouttelettes d'unique et de multiples gouttelettes (rafales), mis en générateur d'impulsions à «E. BUR" mode
   2. Pour l'éjection de gouttelettes en continu, mis en générateur d'impulsions à "NORM" mode
4. Modifier les paramètres du signal
   1. Réglez le niveau de haute et basse tension de sortie niveau: HIL à 5 V et de LOL à 0 V et assurez-vous de la «LIM» est allumée
   2. Régler le signal comme un signal carré
   3. Changer la quantité de temps l'électrovanne est ouverte pour l'éjection de gouttelettes en changeant la valeur de "IFD" ou le changement cyclique («devoir»)
   4. Modifier la fréquence d'éjection en changeant la valeur de "PER"
   5. Modifier le nombre de gouttelettes éjectées dans un élan en changeant la valeur de "BUR"
5. Solution cellulaire éjection sur le substrat préparé pour l'imagerie au microscope

Coloration C.

1. Maquillage solution de colorant avec 0,5 uL calcéine-AM et 2 uL d'éthidium homodimère par ml de DPBS
2. Plongez substrat préparé dans une solution de teinture
3. Laisser l'échantillon à incuber pendant 10 minutes à 37 ° C avant d'imagerie

Validation Experiment

1. Sur un Nikon Eclipse TE-2000 U microscope à fluorescence
   1. Logiciels avancés spot (Diagnostics, Inc)
   2. Live / Dead Assay

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope		Nikon Instruments	Eclipse TE-2000 U Éjecteur
de cellule d’électrovanne				Fréquence de fonctionnement : 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Pilote de vanne : 2,5 ampères courant d’entraînement
gallons Réservoir		Coleman	Powermate CT5	Air sous pression : 30 PSI
Régulateurs de		Marsh Bellofram
Générateur			d’impulsions HP8112A	Génération de fréquence d’actionnement : 50 MHz
Systèmes		Newmark à étage		avec moteur pas à pas : étage xy de déplacement de 6 pouces (NLS4-6-25), étage z de déplacement de 2,5 pouces (NLS4-2.5-25), contrôleur 3 axes (NSC-G3), résolution de 0,1 um
NIH 3T3	Fibroblastes de	lignée
Trypsine				Solution à 0,05 %
NIH 3T3 Milieu
cellulaire DPBS	Tampon
T75				Fioles de culture tissulaire
			coniques en plastique	15 ml, pour la culture tissulaire