Exécution personnalisée expériences de micropuces MicroRNA

Résumé

Une procédure simple d'effectuer des expériences de micropuces personnalisées microARN est décrite. Les étapes comprennent isoler l'ARN, l'étiquetage ARN et l'ADN de référence, l'hybridation des échantillons à puces, la numérisation des microarrays, quantifier et analyser les signaux d'hybridation.

Résumé

microARN (miARN) sont une grande famille de ~ 22 nucléotides (nt) de longues molécules d'ARN qui sont largement exprimés dans les eucaryotes ^1. Génomes complexes codent pour au moins plusieurs centaines de miARN, qui sont principalement inhiber l'expression d'un grand nombre de gènes cibles de post-transcriptionnel ^{2, 3.} miARN contrôler un large éventail de processus biologiques ^1. En outre, l'expression du miARN modifié a été associée à des maladies humaines telles que les cancers, et miARN peuvent servir de biomarqueurs pour les maladies et le pronostic ^{4, 5.} Il est donc important de comprendre l'expression et les fonctions des miARN dans diverses conditions.

Trois grandes approches ont été employées pour l'expression du miARN profil: PCR en temps réel, puces à ADN et le séquençage en profondeur. La technique des biopuces miARN a l'avantage d'être à haut débit, généralement moins coûteux, et la plupart des étapes expérimentales et l'analyse peuvent être CarrIED dans un laboratoire de biologie moléculaire à la plupart des universités, écoles de médecine et des hôpitaux associés. Ici, nous décrivons une méthode pour effectuer des expériences de micropuces personnalisées miARN. Un ensemble de sondes miARN seront imprimés sur des lames de verre pour produire des puces miARN. L'ARN est isolé en utilisant une méthode ou d'un réactif qui préserve les espèces de petits ARN, puis marquées avec un colorant fluorescent. Comme contrôle, oligonucléotides d'ADN de référence correspondant à un sous-ensemble des miARN sont également marqués par un colorant différent de fluorescence. L'ADN de référence servira à démontrer la qualité de la lame et l'hybridation et sera également utilisé pour la normalisation des données. L'ARN et l'ADN sont mélangés et hybridés sur une lame de biopuces contenant des sondes pour la plupart des miARN dans la base de données. Après le lavage, la lame est scanné afin d'obtenir des images et des intensités des spots individuels quantifiés. Ces signaux bruts seront encore traitées et analysées que les données d'expression de l'miARN correspondants. MicroAdiapositives rray peut être dépouillé et régénérée pour réduire le coût des puces à ADN et à renforcer la cohérence des expériences sur biopuces. Les mêmes principes et les procédures sont applicables à d'autres types d'expériences de micropuces personnalisées.

Protocole

1. Impression de puces personnalisées miARN

1. Imprimer la puce diapositives en utilisant les services biopuces installation de base à une université ou une entreprise. La qualité de fabrication de puces à ADN est l'un des facteurs les plus critiques pour le succès d'une expérience microarray. Essayez un peu de services si possible. Idéalement, il faudrait imprimer de 50 à 100 lames à la fois, et toutes les diapositives sera identique, avec bien séparés, les taches individuelles.
2. Pour le support de microréseau, nous utilisons des lames GAPS II couché.
3. Pour les sondes miARN, nous utilisons le nCode multi-espèces miARN Microarray Probe Set V2.
4. Dissoudre tous les oligonucléotides dans 3 x SSC à 10 uM et quadruply les imprimer sur les diapositives. Fixer les lames par irradiation aux ultraviolets conformément aux instructions pour les diapositives II GAAP. Étiquette de la diapositive avec un stylo de diamants pour marquer la zone et le côté avec les sondes imprimé. Magasin à 22 ° C.

2. La préparation des échantillons

1. Toute méthodeou réactif peut être utilisé pour isoler l'ARN, tant qu'elle préserve les petits ARN. Nous utilisons généralement Trizol (Invitrogen) pour extraire l'ARN total, avec la quantité satisfaisante et la qualité des préparations d'ARN, tel que mesuré par A et A _{260 nm} lectures _280nm.
2. Pour l'ARN étiquetage, mélanger ~ 25 ug d'ARN total avec 0,5 ug de 5'-PCU-DY547-3 ^'6 en 1 x tampon (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 _mM MgCl2, 10 ug / ml de BSA, 10% DMSO) contenant environ 20 unités de T4 ARN ligase 1, complétée par la TNT ~ ~ 10 mM et 0,02 à 0,03 volume final de la 10 x T4 ARN ligase 1 tampon pour l'ATP.
3. Autoriser l'étiquetage de procéder sur glace à l'intérieur d'un réfrigérateur pour les 2-24 heures. Précipiter l'ARN, avec 0,3 M d'acétate de sodium et 3 volumes d'éthanol. Pour la ligature efficace et précipitations, dissoudre l'ARN total à plus de 2 mg / ml, et maintenir le volume total de la ligature à ~ 20 pl.
   1. Si moins d'ARN est disponible, le montant de l'apport de l'ARN et le 5'-PCU-DY547-3 'peuvent être revus à la baisse.
   2. Si l'ARN est très dilué, ajouter transporteur comme ARNt de levure pour l'aide dans les précipitations.
4. Combinez et étiquettes au total 1 ug d'oligonucléotides d'ADN de référence correspondant à un sous-ensemble des miARN de mammifères en utilisant les Ulysis Alexa Fluor 647 Kit Nucleic Acid Étiquetage ⁶ comme un contrôle pour le processus d'hybridation. Purifier l'ADN marqué à l'aide d'une colonne Centrisep et sauvegarder dans l'obscurité à -20 ° C.

3. L'hybridation microarray

1. Pour utiliser les diapositives pour la première fois, la pré-hybridation des lames dans une solution filtrée de 3 x SSC, SDS 0,1%, 0,2% de BSA pendant 30-60 min à 37 ° C. Les submerger dans l'eau à quelques reprises, puis à l'isopropanol. Sécher les lames à l'aide d'une centrifugeuse avec un adaptateur diapositives à 100 g pendant 5 min à 22 ° C.

Note: Nous utilisons des chambres Corning hybridation microarray et mSeries Érié scientifique de Lifterslips pour effectuer l'hybridation de biopuces.

2. Rincez le lifterslips dans l'eau, puis dans de l'éthanol, avant le séchage à l'air. Placez une diapositive dans une base de microréseaux chambre d'hybridation, et un lifterslip sur le dessus de la glissière. Le lifterslip couvrira la zone de la sonde, avec ses bandes blanches contactant la diapositive.
3. Dans l'obscurité, le ralentissement de la précipitation, l'ARN étiquetés. Lavez une fois avec 70% d'éthanol, et l'air sec du culot. Le culot doit être rougeâtre.
4. Préparer une solution d'hybridation contenant 400 mM de Na ₂ HPO ₄ pH 7,0, 0,8% de BSA, 5% de SDS, le formamide 12% ⁶ avec 1/15-1/100 pl de la purifier, étiquetées ADN de référence (2,4) par échantillon d'ARN. La quantité d'ADN de référence ajoutée dépend du nombre de différents oligonucléotides sont étiquetés (2,4). S'il ya plus de 100, alors moins de dilution est nécessaire.
5. Dissoudre le culot d'ARN bien avec ~ 60 pl de la solution d'hybridation.
6. Ajouter 20 ul d'eau pour chacun des puits d'humidification dans la base de microréseaux chambre d'hybridation Corning.
7. Ajouter tIl mélange de l'ARN et l'ADN de référence étiqueté à la diapositive. Utiliser une pipette fine, toucher doucement le bord de la lifterslip, et permettre à la solution d'entrer dans l'espace entre les lifterslip et glisser à travers aspiration.
8. Placer la chambre d'hybridation couvrent plus de la base, puis sceller la chambre avec des pinces métalliques.
9. Mettez toute la chambre à l'intérieur du sac en plastique qui vient avec la cassette de chambre de Corning.
10. Placer la cassette de chambre (s) à l'intérieur d'un conteneur avec une serviette de papier mouillé; couvrez le récipient avec une pellicule plastique et placez-le dans un 37 ° C et humide, de culture cellulaire incubateur pour ~ 24 heures. Ces précautions (3,6, 3,9, 3,10) s'assurer que la solution d'hybridation ne se dessèche pas pendant l'incubation.

4. Post-traitement de l'hybridation

1. Démonter les cassettes de chambre, un par un. Plonger une lame et son lifterslip en 2 x SSC à 22 ° C. Le lifterslip va naturellement tomber la lame. Placez-le dans 0,8 x SSC. Laverles diapositives de 0,8 x SSC deux fois, puis trois fois en 0,4 x SSC, 1-2 min au total. Sécher les lames à l'aide d'une centrifugeuse avec un adaptateur de diapositives. Laver les lifterslips avec de l'eau et à économiser pour les réutiliser plus tard.
2. Numérisez les diapositives avec n'importe quel scanner approprié, par exemple, l'Perkin Elmer ScanArray 5000 ou Molecular Devices Axon GenePix 4000B biopuces scanner. Balayage des longueurs d'onde proche de 547 nm et 647 nm pour obtenir les fichiers d'image correspondante.
3. Utiliser des programmes tels que BlueFuse de quantifier les intensités des pixels dans l'entrée, les fichiers image de 4,2). Inspectez taches individuelles avec le programme d'exclure des taches anormales sur les microarrays d'un examen plus approfondi. Ces taches anormales résultent habituellement d'imprimerie glisser mauvaise manipulation ou une diapositive après hybridation.
4. Utiliser des programmes tels que GeneSpring et Excel pour l'analyse des données et la présentation. Considérations générales pour la normalisation des données biopuces s'appliquent, ce qui est au-delà de la portée du présent document.
5. Une fois les signaux satisfaisants sont obtenus after 4,3), la bande des lames microarray pour réutilisation ^7. Rincer les lames dans de l'eau, puis plonger dans préchauffé, NaOH 1 mm et 0,1 x SSC dans un plat à coloration à 62 ° C pendant 10-20 minutes. Répétez l'incubation fois. Lavez le C. diapositives à quelques reprises dans l'eau pendant 60 minutes avec agitation douce à 22 ° Sécher les lames à l'aide d'une centrifugeuse, et conserver à 22 ° C.
6. Pour utiliser les diapositives régénéré, il n'est pas nécessaire de les pré-s'hybrider à nouveau. Il suffit de les laver à l'eau suivie de l'isopropanol, et sécher les diapositives à droite avant l'hybridation.

5. Les résultats représentatifs:

Nous avons largement suivi les procédures décrites au profil de l'expression du miARN mondial dans des milliers d'échantillons, c'est-à ARN isolé de poisson zèbre au spécimen humain dans diverses conditions. La figure 1 montre une image numérisée d'une biopuce à démontrer signaux d'hybridation très précis et très forte sur le diapositive. Le correlati Pearsonsur les coefficients techniques entre les répliques de l'hybridation microarray sont ~ 0.99 ^7, indiquant une excellente reproductibilité.

Figure 1 Image composite d'une lame de biopuces miARN numérisée après l'hybridation. Taches rouges résulté de hybridations par l'ADN de référence, des taches vertes de l'échantillon DY547-ARN marqué, tandis que les taches jaunes étaient d'hybridations à la fois par l'ADN et d'ARN pour les mêmes sondes.

Discussion

Malgré les progrès récents dans les technologies de séquençage profond, biopuces reste un choix viable pour analyse à haut débit de l'ADN et l'ARN. Comparé à un séquençage en profondeur, les expériences biopuces sont moins chers, et un laboratoire de biologie moléculaire typique peut exécuter la plupart des expériences et l'analyse des données en interne, ce qui permet une flexibilité et un gain de temps. Dans l'avenir, les puces sont susceptibles bien adapté à interroger de manière intensive des ensembl...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Articles	Vendeur	Numéro de catalogue	Commentaires
NCode multi-espèces miARN Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Conçu sur la base des miRBase 9.0 Release (Octobre 2006). Il contient ~ 1140 non modifiées, des oligonucléotides de 34 à 44 nt longtemps que les sondes pour le ver, la mouche, le poisson zèbre, souris, rat, et miARN humains, et un certain nombre de sondes de contrôle interne tels que snoRNAs. Les sondes sont des doublets miARN des séquences complémentaires à miARN mature, donc la taille de ~ 44 nt. Pour l'analyse, on peut se concentrer sur miARN à partir d'un génome particulier (s) d'intérêt.
Trizol	Invitrogen	15596018	Nous avons également utilisé enrichi, petite fraction ARN pour l'étiquetage, bien que les échantillons d'ARN totaux sont plus rapides et plus faciles à préparer et à quantifier et adapté aux applications en aval tels que l'analyse d'ARNm.
T4 ARN ligase 1	La Nouvelle-Angleterre Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Kit Nucleic Acid Etiquetage	Invitrogen	U21660	Ce kit ou des produits similaires peuvent être utilisés pour étiqueter les échantillons d'ARN expérimentale ou d'un ARN de contrôle (au lieu de l'ADN de contrôle) ainsi.
5'-PCU-DY547-3 '	Dharmacon	Custom made	Petite fraction d'ARN peuvent être également étiquetés par ligature.
Colonnes Centrisep	Séparations Princeton	CS-901
GAPSII lame revêtue	Corning	40004	D'autres types de lames peuvent être également utilisés.
Chambres d'hybridation microarray	Corning	2551 ou 40080	D'autres types de chambres d'hybridation et de lamelles devrait également fonctionner. En utilisant l'hybridation des machines disponibles dans le commerce peut réduire significativement le temps l'hybridation, par exemple, à 2 heures.
Lifterslips	Th.Ermo / Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent