La culture et l'électrophysiologie des cellules sur la SCGDV de patch-clamp Chips

Résumé

Nous montrons comment plane de patch-clamp puces fabriquées au sein du Conseil national de recherches du Canada sont stérilisés, apprêté, chargé avec le milieu, plaqué avec des cellules, et utilisé pour les enregistrements électrophysiologiques.

Résumé

En raison de sa sensibilité exquise et la capacité de surveiller et de contrôler des cellules individuelles au niveau des canaux ioniques, patch-clamp est l'étalon-or de l'électrophysiologie appliquée aux modèles de maladies et les écrans aussi bien pharmaceutiques ^1. La méthode implique traditionnellement doucement en contact une cellule avec une pipette en verre remplie d'une solution physiologique dans le but d'isoler une parcelle de la membrane sous son sommet ^2. Une électrode inséré dans la pipette capture d'ions de canal activité dans la pièce de membrane ou, lorsque la rupture, pour la cellule entière. Dans la dernière décennie, de patch-clamp puces ont été proposés comme une alternative ^{3, 4:} un film en suspension sépare le milieu physiologique du milieu de culture, et une ouverture microfabriqué dans le film remplace le sommet de la pipette. Patch-clamp puces ont été intégrés dans les systèmes automatisés et commercialisées pour criblage à haut débit ^5. Pour incrla facilité de débit, ils comprennent la livraison fluidique de cellules provenant de la suspension, leur positionnement sur l'ouverture par aspiration, et des routines automatisées pour détecter cellule-à-sonde joints, entrer en mode cellule entière. Nous avons présenté un rapport sur ​​la fabrication d'un silicium de patch-clamp puce avec une impédance optimale et la forme orifice qui permet l'enregistrement de haute qualité de potentiels d'action dans les neurones d'escargots d'élevage ^6; récemment, nous avons également fait état ​​de progrès vers l'interrogation neurones de mammifères ^7. Nos patch-clamp puces sont fabriquées au Centre canadien de fabrication de dispositifs photoniques ^8, une fonderie commerciale, et sont disponibles en grande série. Nous sommes désireux de s'engager dans des collaborations avec des électrophysiologistes pour valider l'utilisation de la technologie CNRC dans différents modèles. Les copeaux sont utilisées selon le schéma général représenté dans la figure 1: la puce de silicium est au fond d'un flacon de culture plexiglas et l'arrière de l'ouverture est reliée à une souterraine Channel munie de tubes à chaque extrémité de l'emballage. Les cellules sont cultivées dans le flacon et la cellule au-dessus de la sonde est contrôlée par une électrode de mesure insérée dans les deux channel.The en dehors des ports fluidiques faciliter l'échange d'une solution avec une perturbation minimale de la cellule, ce qui est un avantage par rapport aux pipettes en verre pour intracellulaire perfusion.

Figure 1. Principe de la mesure à l'aide de la SCGDV patch-clamp puce

Nous détaillons ici les protocoles de stérilisation et d'amorcer les puces, les charger avec le milieu, la plaque entre eux avec des cellules, et enfin les utiliser pour les enregistrements électrophysiologiques.

Protocole

1. La fabrication de puces

Le processus décrit dans ⁶ résultats dans un 3 um d'épaisseur autonome film, une faible résistance 1 Mohm et un accès à surface lisse d'entonnoir en forme qui facilite l'ouverture d'un sceau intime avec la cellule ^9, voir la figure 2. Les puces sont individualisés et collées dans des emballages en plexiglas avec l'ouverture face à un trou de connexion de la puce à un canal souterrain. Le collage est distribué d'une manière qui minimise la capacité de dérivation pour une valeur nominale 17 pF. Les colis sont équipés de deux piles de 1,5 mm de diamètre et 6 mm tubes de verre longues que les ports fluidiques (Figure 3).

Figure 2. Microscope électronique à balayage d'un faisceau d'ions focalisé section d'un SCGDV patch-clamp puce montre une surface de silicium lisse dioxyde de carbone et en forme d'entonnoir qui favorise les contacts cellulaires intimes, et un orifice de faible profondeur qui représente une faible accès resistance.

Figure 3. Une puce est collée au fond du flacon de culture dans un paquet de plexiglas équipé fluidique souterraines et des tubes de verre.

2. Stérilisation, l'amorçage et les tests

Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter la contamination ou de brancher de l'ouverture.

• Stériliser jetons dans un nettoyeur de base Harrick plasma (www.harrickplasma.com) avec une pression de 0.1 à 0.3 mbar air résiduel pendant 15 min à la puissance maximale de 18 W. Les autres systèmes de plasma d'air peut être utilisé, avec une densité de puissance comparable (24 mW / cm ³⁾ et à maintenir le produit de la densité de puissance et la constante de temps. Le traitement par plasma rend aussi les puces hydrophile, qui facilite l'amorçage.
• Monter des tubes de verre avec tube stérile Laboratoire de silicone Silastic, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96115 à 08), sur un côté 3inch, 1 pouce de l'autre côté.
• Remplissez fluidique à travers les tubes avec une solution stérile de tampon standard filtrée phosphate (PBS), en s'assurant qu'aucune bulle est piégée.
• Clip du tube de silicone longtemps mise sous pression du PBS à partir du côté le plus court à 1 atm. Une piscine de PBS qui suinte à travers l'ouverture pourrait être visible dans le flacon. Clip de l'offre sous pression de la PBS et détacher le tube de silicone court à partir de cette offre.
• Remplissez le flacon avec filtration PBS à l'aide d'une seringue.
• Immerger une Ag / Ag: électrode de Cl dans le tube court et une contre-électrode dans le flacon. Un impédancemètre est utilisé pour confirmer que la résistance d'accès se situe entre 300kohm et 3Mohm et la capacité de shunt est entre 10pF et 25pF. Une puce avec une diminution de la résistance est susceptible d'avoir une fuite, et une capacité plus élevée est considérée comme impropre pour une utilisation comme il peut ne pas capturer les plus rapides la dynamique de l'électrophysiologie de la cellule ^6. Une puce avec une capacité plus faibleou une résistance plus élevée est considérée comme branché, mais il pourrait simplement s'agir d'une bulle est piégée dans l'orifice. Certaines puces sont un nouveau test après 1H et constaté que l'impédance électrochimique correcte.
• Rincer le canal fluidique avec de l'eau déminéralisée stérile; vider le flacon dessus et rincer avec le même, à deux reprises.
• Immergez la puce emballé avec des tubes dans l'eau fraîche désionisée stérile pendant 30 minutes puis de charger avec d'autres puces dans un récipient stérile rempli avec de l'eau déminéralisée stérile. Cela garantit que les puces restent hydrophile et protégés de toute contamination.

3. Préparation Chips dans le laboratoire de biologie cellulaire

Les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte laminaire HEPA filtré de flux en utilisant les techniques d'asepsie, toutes les solutions utilisées dans cette procédure doit être filtrée stérilisés avant leur utilisation à l'aide d'un filtre 0.22μm.

• Ouvrez un conteneur à puce sous une hotte laminaire HEPA filtré débit et retirer des jetons de container face vers le bas pour éviter l'excavation éventuels contaminants flottants dans le flacon haut.
• Rincer haut de flacon de 2x à puce avec l'eau fraîchement filtrée désionisée stérile afin de retirer tous les débris résiduels de la surface de la puce.
• Aspirer l'eau stérile déionisée hors du flacon en haut.
• Branchez une extrémité du tube silastic attaché à la chaîne fluidique à une seringue stérile sous pression contenant de l'eau filtrée désionisée. Dans notre système, les seringues remplies de solution sont mis sous pression par la connexion à un réservoir d'air comprimé réglé à 20 psi. Pour assurer la stérilité, l'air est filtré (filtre de 0,22 um) avant l'entrée dans la seringue et de notre système dispose également d'une vanne de marche / arrêt qui nous permet d'arrêter ou de faire pression en cas de besoin.
• Utilisation d'une pince hémostatique, serrer l'extrémité de sortie de la tubulure.
• Ouvrir le soupapes allumées / éteintes pour mettre sous pression la solution.
• À rincer le fluide subterranen de la puce avec l'eau fraîche déminéralisée stérile, déblocage l'extrémité de sortie du tube.
• Pour desCE l'eau à travers l'ouverture, fixer l'extrémité de sortie de la tubulure avec une pince hémostatique.
• Pour éviter le drainage de l'eau, serrer les extrémités d'entrée et de sortie de la tubulure avec une pince à bec et fermer la marche / arrêt vannes.
• Détachez l'extrémité d'entrée du tube de la seringue.
• Insérer les bouchons de verre dans les deux extrémités du tube et enlever les pinces hémostatiques.
• Remplissez le flacon avec de l'eau dessus steriled filtre désionisée.
• Placer le couvercle d'une boîte de 35 mm stérile dans la base d'un plat de 100 mm stérile
• Puce Déposer sur le dessus du couvercle de 35 mm et la couverture avec 100 couvercle de boîte de mm.
• Puces d'image afin de s'assurer que la membrane et l'ouverture des puces sont exempts de débris et / ou des bulles d'air. Dans notre laboratoire, nous utilisons un microscope droit et un objectif 20x longue distance de travail.
• Si des débris et / ou des bulles d'air sont présents, à plusieurs reprises rincer le canal fluidique et le flacon haut. Si les débris et / ou des bulles d'air ne peuvent pas être enlevé de la puce est éliminé.
• Une fois que les puces sontimagé, retourner à hotte à écoulement laminaire et débrancher les deux extrémités de la tubulure.
• Attacher une extrémité de la tubulure à une seringue sous pression contenant les milieux physiologiques.
• Serrer l'extrémité de sortie de la tubulure avec une pince hémostatique
• Ouvrir la vanne de pression, retirer la pince hémostatique de l'extrémité de sortie de la fluidique et rincer le canal fluidique avec les milieux physiologiques
• À rincer le fluide souterrain avec les milieux physiologiques, ouvrir le soupapes allumées / éteintes et enlever la pince hémostatique de l'extrémité de sortie de la tubulure.
• Pour forcer les milieux physiologiques à travers l'ouverture, fixer l'extrémité de sortie de la tubulure avec une pince hémostatique.
• Pince extrémité d'entrée de la tubulure avec une pince hémostatique et fermer l'soupapes allumées / éteintes.
• Retirez l'extrémité d'entrée du tube de la seringue et branchez les deux extrémités du tube avec des bouchons glas.
• Retirer les pinces hémostatiques.
• Enlevez l'eau du flacon en haut.
• Remplissez le flacon dessus avec filtre stérilisés milieux physiologiques.
• Placez le dos à puce dans le plat de 100 mm de Petri.
• Placer la base d'un plat de 35 mm dans la boîte de 100 mm et le remplir avec de l'eau désionisée filtre stérilisé pour enrichir l'humidité.
• Couvrir le plat jusqu'à ce qu'il soit temps pour le placage

4. Placage cellulaire des neurones d'escargots

Les puces de patch-clamp peut être approprié pour une variété de préparations. Nous sommes en train de tester nos puces avec des mammifères primaires neurones corticaux et ont obtenu des résultats préliminaires avec des cellules cultivées pendant 14 jours ^7, qui indique que notre protocole de stérilisation est adéquate et que les puces ne sont pas cytotoxiques à long terme des cultures. Pour l'application de ce protocole, les neurones d'escargots ont été choisis parce qu'ils représentent un modèle simple, mais bien établie pour étudier neuronale électrophysiologie ^11, et c'est avec ces cellules que nous avons obtenu les résultats les plus significatifs à ce jour ^10. L'isolement des cellules et des procédures détaillées de la culture ontété décrit précédemment ^{12, 13.}

• Retirer la coquille externe de 2-3 mois Lymnaea stagnalis vieux forceps émoussé et les animaux anesthésier dans une solution saline contenant Lymnaea Listerine 10%.

  Toutes les étapes subséquentes réalisée de manière aseptique à l'intérieur d'une hotte flux d'air laminaire avec un équipement de dissection stérilisé et des solutions à la température ambiante.

• Remplacer les milieux physiologiques dans les fluidique avec la solution d'enregistrement approprié à l'aide d'une pipette Eppendorf. Dans le cas de neurones Lymnaea la solution contient (en mM): 50 KCl, MgCl ₂ 5, 5 éthylènebis (oxyéthylènenitrilo) tétraacétique (EGTA) et 5 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES; pH 7,4 , 130 mOsm) ¹⁴
• Epingler les escargots dans un plat rempli de Sylgard Lymnaea une solution saline et de supprimer cerveau entier tel que décrit précédemment ¹³
• Traiter le isolatcerveaux éd dans les médias définis (DM) avec trypsine (solution à 0,2%, Sigma, catalogue # T-9201) pour 18 minutes, suivie par un traitement en DM et inhibiteur de la trypsine (Sigma, de soja, Catalogue # T-9003) pendant 15 minutes.
• Epingler les cerveaux dans un plat rempli de Sylgard petite osmolarité élevée définie médias (HODM - DM avec le glucose ajouté, 750 pi de solution de glucose 1M à 20 ml de DM).
• En utilisant des pinces fines et les ciseaux de dissection, retirer la gaine extérieure et intérieure des ganglions de l'intérêt, d'exposer les neurones.
• En utilisant une pipette en verre poli feu rempli de HODM et attaché à une microseringue, appliquer une aspiration douce près de la cellule d'intérêt (gauche dorsale pédale 1) jusqu'à ce que le neurone se détache du cerveau et est suspendu dans la pipette.
• La pipette de verre est ensuite déplacé et trempée dans neuropuces individuels lorsque l'éloignement de la douceur microseringue permet aux neurones d'être légèrement poussé hors de la pipette et placé au-dessus des trous de raccordement individuels sur les puces.
• Laisser les cellules tranquille pendant un minimum de 2h à température ambiante afin de promouvoir leur attachement à la surface de la puce qui entoure l'ouverture.

5. Des enregistrements électrophysiologiques

Pour connecter les puces à l'amplificateur (dans notre cas un amplificateur Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, Etats-Unis)

• Remplacer la solution dans le fluide souterrain et dans le flacon puce avec les solutions d'enregistrement appropriées. Dans le cas de neurones Lymnaea, les chambres de culture supérieures sont remplis d'une solution saline Lymnaea (en mM: 51,3 NaCl, KCl 1,7, 4 CaCl 2, MgCl 2 et 1,5) tamponnée à un pH de 7,9 à ¹⁴ HEPES.
• Pour plus de stabilité, de la colle la puce sur une lame de verre et le placer sous un microscope.
• Pour connecter la puce à l'amplificateur (dans notre cas un amplificateur Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, Etats-Unis), couper un bout du tube et insérez une SilveFil r qui est relié à la tête-étape.
• Placer l'électrode de référence dans le flacon supérieure de la puce.
• La puce est maintenant prêt pour l'enregistrement.
• Appliquer une étape 5 mV avec l'amplificateur pour mesurer la résistance totale (R _t) et déterminer la configuration des neurones: cellule attenante (R _t> 1 GQ); cellules entières (Rt = 50-100 transitoires MQ ainsi capacitif, ce qui indique la rupture des membranes sur l'ouverture), ou pas de sceau (R _t <5 MW). Dans notre dernière série d'expériences ^10, 58 pour cent% des cellules avaient joints à haute résistance et, de ceux, 80% des cellules ont montré des réponses excitables.

6. Les résultats représentatifs

• Appliquer dépolarisant impulsions de courant (20 incrément pA) au neurone (dans ce cas LPeD1).
• Tenez le neurone à près Vm à son potentiel de repos (~ - 60 mV).
• Observez les réponses à ces impulsions dépolarisantes. Potentiels d'action devrait surréactionêtre observé si le neurone est viable.
• La figure 4 montre un résultat représentatif qui est discuté en détail dans les ^{14, 15.}

Réponses de tension Figure 4. (En haut) d'un neurone à LPeD1 série graduée de intracellulaires des impulsions de courant (ci-dessous). Les impulsions de courant ont été appliqués à Vm = - 60 mV.

Dépannage

• Avant de placage, copeaux d'image pour déterminer si la membrane et l'ouverture sont exempts de débris et adapté pour le placage. Nous utilisons un microscope droit et un objectif 20x longue distance de travail. Dans notre dernière série d'expériences ^1, 67 pour cent% de copeaux ont été amorcée avec succès de cette manière.
• Si des débris et / ou des bulles d'air sont présents jetez puce et essayer un autre.
• Divers traitements de surface (plasma) ou revêtements (PDL, PEI, etc) peut être essayé, mais le succès peut être très dépendant de type de celluleutilisée.
• La composition de la fluidique ("pipette") dans une solution critique pour la formation de la giga-joint et l'ensemble de cellules-. Ajuster la solution, en accordant une attention à l'osmolarité, le pH, et le maquillage ionique.
• Pour la culture à plus long terme, commencer par les médias dans le canal microfluidique, puis passer à pipeter une solution avant l'enregistrement par la gravité de perfusion douce alimenté (~ 0,5 ml / min).

Discussion

SCGDV patch-clamp plate-forme d'interrogation à puce est un outil potentiellement puissant pour haute dosages contenu de l'information pharmaceutiques et d'enquêter sur des modèles in vitro de la maladie. Ses avantages par rapport aux pipettes en verre sont une résistance faible accès, qui est un avantage pour sonder les grandes cellules, et en dépit d'une capacité un peu plus grande se traduira par la dynamique comparables pour les petites cellules. Cellulaire spontanée à joints d'ouverture ont été obtenus en routine, et l'entrée de cellules entières a été observé que ¹⁴ spontanée. Un nette différence entre les puces et la méthode de pipette de verre est le fait que la sonde est une partie de la boîte de culture cellulaire et n'est pas manuellement mis en contact avec la membrane cellulaire. La culture de cellules, peut-être une partie de réseaux fonctionnels, les résultats dans des modèles plus biologiquement pertinentes comme modèles de maladies, et un mécanisme différent pour obtenir des cellules haute pour sonder les phoques ^16. Cependant, par contraste avec des suspensions cellulaires aspiration, Canot être utilisé pour positionner une cellule sur la sonde. Neurones d'escargots, comme d'autres grandes cellules, se prêtent à un positionnement manuel sur le dessus de la sonde. Pour le placement des cellules plus petites nécessitant des temps de culture plus longues, nous avons éliminé la nécessité de toute manipulation et de garder une forte probabilité de l'obtention d'un joint d'étanchéité par des polypeptides d'adhésion de structuration sur le dessus des sondes pour placer les cellules au-dessus des sondes, et a démontré des cellules sur le sonde ^17,18.

SCGDV développe aussi un polyimide microfluidique patch-clamp puce ¹⁹ avec une capacité comparable à celle du verre de pipette. Le but ultime de ce projet est un multiple des sondes de patch-clamp à puce qui permet le contrôle simultané de l'activité électrophysiologique des neurones engagés dans plusieurs comportement du réseau à la résolution des canaux ioniques individuels ^14. Cette méthode est une méthode complémentaire à haute résolution réseaux d'électrodes multi-20.