Modification de la direction et l&#39;orientation du champ électrique pendant des impulsions électriques d&#39;application améliore le transfert de gène plasmidique In vitro</em

Résumé

Transfection de gènes par électroporation est amélioré d'environ deux fois lorsque l'orientation du champ électrique est changé lors de l'application d'impulsions, tandis que la viabilité des cellules n'est pas affectée. L'augmentation de la transfection de gènes est causée par l'augmentation de la surface de membrane qui est rendue compétente pour l'entrée d'ADN dans la cellule.

Résumé

Gene électrotransfert est une méthode physique utilisée pour délivrer des gènes dans les cellules par l'application de courtes et intenses impulsions électriques, qui provoquent la déstabilisation de la membrane cellulaire, ce qui rend perméable aux petites molécules et permet le transfert de grosses molécules comme l'ADN. Il représente une alternative aux vecteurs viraux, en raison de son innocuité, l'efficacité et la facilité d'application. Pour gène électrotransfert différents protocoles d'impulsions électriques sont utilisés pour atteindre un maximum transfection de gènes, l'un d'eux est changeant la direction du champ électrique et d'orientation lors de la livraison d'impulsion. Changement de direction du champ électrique et d'orientation augmenter la surface de membrane compétents pour l'entrée d'ADN dans la cellule. Dans cette vidéo, nous montrent la différence dans l'efficacité électrotransfert de gènes lorsque toutes les impulsions sont livrés dans la même direction et quand impulsions sont délivrées en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation. Pour cette astuce objectif avec des électrodes intégrées et générateur de prototypes de haute tension, ce qui permet de changer de champ électrique dans des directions différentes pendant l'application d'impulsions électriques, ont été utilisés. Gene électrotransfert efficacité est déterminée 24h après l'application d'impulsions que le nombre de cellules exprimant la protéine fluorescente verte divisée par le nombre de toutes les cellules. Les résultats montrent que la transfection du gène est augmenté lorsque l'orientation du champ électrique au cours d'impulsions électriques de livraison est modifié.

Protocole

1. La culture cellulaire, un plasmide et la préparation de tampon pour l'expérience

1. Dans cette expérience ovariennes de hamster chinois (CHO-K1) sont utilisés. Les cellules sont cultivées dans un mélange nutritif HAM-F12 (AAP) supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 10% de sérum fœtal bovin, 400 ul / l gentamicine (tous de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Allemagne), et 1 ml / L crystacilin (Pliva, Zagreb, Croatie). Les cellules sont maintenues à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée ₂ à 5% l'atmosphère dans l'incubateur pendant 24 heures.
2. Amplifier plasmide pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc, Mountain View, Californie, Etats-Unis) codant la protéine fluorescente verte (GFP) dans la souche DH5a d'Escherichia coli et l'isoler avec Maxi Kit HiSpeed ​​plasmidique (Qiagen, Hilden, Allemagne). Concentration de l'ADN plasmidique (plasmide dissous dans un tampon TE) devrait être déterminée par spectrophotométrie à 260 nm et confirmée par électrophorèse sur gel.
3. Préparer isoosmolar tampon phosphate de sodium (10 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM NaH ₂ PO _4, 1 _mM de MgCl2, 250 mM de saccharose, pH 7,4).
4. Le jour de l'expérimentation de préparer la suspension cellulaire par trypsinisation avec 0,25% de trypsine / EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Allemagne). Centrifuger les cellules pendant 5 min à 1000 rpm (180 xg) à 4 ° C (Sigma, Allemagne) et remettre le culot cellulaire dans un tampon de phosphate de sodium isoosmolar à une densité cellulaire de 5 × 10 ⁶ cellules / ml.

2. L'équipement matériel

1. Les cellules sont exposées à des champs électriques dans la pointe de pipette (figure 1) avec des électrodes intégré connecté à un générateur de prototypes de haute tension. La pointe et la géométrie d'électrodes permet l'application de champ électrique relativement homogène et le générateur permet la livraison d'impulsions électriques dans différentes directions. La pointe et le générateur ont été développés au Laboratoire de Biocybernétique, Faculté de Génie Electrique, Université de Ljubljana ^1.

Figure 1. Verticale et horizontale (a) section transversale et la photographie (b) de la pointe de la pipette avec des électrodes intégrées. Dans la couleur grise de section est utilisé pour le boîtier en plastique noir et pour les électrodes. La pointe de la pipette avec des électrodes intégrées se compose de quatre électrodes tige cylindrique. Les électrodes sont faites d'acier inoxydable; leur diamètre est de 1,4 mm, électrodes adjacentes sont de 1 mm d'intervalle, et les électrodes opposées sont de 2 mm d'intervalle. Les électrodes sont collées dans le bout de plastique en parallèle et leur longueur applicable est de 30 mm ^2.

3. Gene électrotransfert protocole

1. Ajouter plasmide pEGFP-N1 à une suspension cellulaire de la concentration de 10 ug / ml.
2. Incuber le mélange pendant 2-3 minutes à température ambiante, avant d'appliquer des impulsions électriques.
3. Aspire 100 pl de suspension cellulaire dans l'embout de la pipette avec des électrodes intégrées.
4. Pour obtenir le meilleur d'efficacité électrotransfert de gènes et de maintenir la viabilité des cellules, les paramètres optimaux d'impulsions électriques doivent être utilisés. Dans cette expérience, un train de 8 impulsions rectangulaires (chacune avec une durée de 1 ms, d'amplitude 225 V à une fréquence de répétition Hz) est appliqué à chaque échantillon, on utilise un générateur de prototypes de haute tension. Deux protocoles différents de champ électrique (figure 2) sont utilisés: dans le premier protocole toutes les impulsions sont délivrées dans la même direction, alors que dans le second protocole impulsions sont livrés en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation. Le deuxième protocole ne peut être utilisé avec le générateur d'impulsions approprié, qui permet l'application d'impulsions électriques dans différentes directions.
5. Immédiatement après l'application d'impulsions de transférer les cellules de la pointe de pipette en 6 plaques et ajouter sérum de veau fœtal (SVF-Sigma, États-Unis) (25% du volume de l'échantillon).
6. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C pour permettre rescellage membrane cellulaire.
7. Ajouter 2 ml de HAM-F12 pour chaque échantillon dans 6 puits et incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée ₂ à 5% l'atmosphère dans l'incubateur.

. Figure 2 protocoles de champ électrique: (a) toutes les impulsions sont délivrées dans la même direction, (b) les impulsions sont livrés en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation.

4. L'acquisition des images et la détermination de l'efficacité du gène électrotransfert

1. Efficacité du gène électrotransfert est déterminée comme le pourcentage de cellules exprimant la GFP 24h après l'application d'impulsions.
2. Les cellules sont observées en utilisant un microscope à fluorescence (dans notre cas Zeiss 200, Axiovert, ZR Allemagne) avec la lumière d'excitation à 488 nm généré par un système monochromateur (polychrome IV, Visitron, Allemagne) et l'émission est détectée à 507 nm. Les images sont enregistrées en utilisant le système d'imagerie (imagerie MetaMorph système, Visitrle, Allemagne), mais d'autres logiciels d'acquisition similaire peut également être utilisé.
3. Acquérir au moins cinq images (contraste de phase et fluorescence verte) à un grossissement de 20x objectif.
4. Compter les cellules à l'image de contraste de phase et les cellules qui expriment la GFP à l'image de fluorescence verte. Déterminer le pourcentage d'efficacité électrotransfert de gènes en divisant le nombre de cellules qui expriment la GFP avec le nombre de toutes les cellules de chaque image correspondant (figure 3).

5. Les résultats représentatifs:

Figure 3. Le pourcentage de cellules exprimant la GFP lorsque toutes les impulsions sont livrés dans la même direction et quand impulsions sont délivrées en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation est présentée. Les cellules ont été exposées à un train de huit impulsions avec une amplitude 225 V, durée 1 ms et la fréquence de répétition de 1 Hz. Les résultats ont été obtenus par des moyens de microscopie à fluorescence. Chaque valeur dans le graphique représentent la moyenne de trois expériences indépendantes ± déviation standard. En changeant la direction du champ électrique et l'orientation du pourcentage de cellules exprimant la GFP augmente.

Discussion

Gene électrotransfert est une technique de la biotechnologie polyvalent qui permet le transfert d'ADN dans les cellules au moyen de l'application de courtes impulsions à haute tension électrique ³ et représente une alternative plus sûre à des vecteurs viraux en raison de sa sécurité, efficacité et facilité d'application. Bien électrotransfert de gènes est aujourd'hui largement utilisé pour transfecter tous les types de cellules et de la première phase I des essais cliniques utilisant cette mét...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
HAM-F12	AAP	E15-016	milieu de culture
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
sérum de veau fœtal	AAP	A15-151
gentamicine	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotiques
crystacilin	Pliva	625110	antibiotiques
pEGFP-N1	Clontech Laboratories	6085-1	l'ADN plasmidique
HiSpeed ​​Maxi Kit Plasmid	Qiagen	12662
Na 2 HPO 4	Merck	F640786 933
NaH 2 PO 4	TKI Hrastnik	0795
MgCl 2	Sigma-Aldrich	M-8266
saccharose	Sigma-Aldrich	16104
trypsine / EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
pointe de la pipette	Custom made
générateur d'impulsions électriques	Custom made
6 plaques ainsi	PPT	92406
15 ml tube à centrifuger	PPT	91015
75 flacon de culture cm 2	PPT	90076