Analyse de la migration cellulaire Tronc Crête neurale en utilisant une modification Zigmond Chambre Assay

Summary

Une approche pour analyser la migration des cellules explantées (cellules de la crête neurale du tronc) est décrite. Cette méthode est peu coûteuse, douce et capable de distinguer la chimiotaxie à la fois de la chimiokinésie et d’autres influences sur la polarité migratoire telles que celles dérivées des interactions cellule-cellule dans la culture cellulaire de la crête neurale du tronc primaire.

Abstract

Cellules de la crête neurale (CCN) sont une population de passage de cellules présentes dans le développement des vertébrés qui émigrent à partir du tube neural dorsal (NT) après avoir subi une ^1,2 transition épithélio-mésenchymateuses. Après EMT, CNC migrer de grandes distances le long des voies stéréotypés jusqu'à ce qu'ils atteignent leurs objectifs. CNC se différencier en un vaste éventail de types de cellules, y compris les neurones, cellules gliales, les mélanocytes et les cellules chromaffines ^1-3. La capacité du CNC à atteindre et à reconnaître leurs emplacements cible appropriée est fondamentale pour la formation appropriée de toutes les structures contenant le tronc de la CCN composants dérivés ^3. Élucider les mécanismes d'orientation pour le tronc de la CCN de migration a donc été un sujet de grande importance. Plusieurs molécules ont été démontrés pour guider la CCN migrations ^4. Par exemple, les CNC du tronc sont connus pour être repoussés par des signaux de guidage négatifs tels que Semaphorin, Ephrine et les ligands fente ^5-8. Cependant, ne pasjusqu'à récemment toute chimiotactiques du CNC du tronc été identifiés ^9.

Conventionnel dans les approches in vitro pour étudier le comportement chimiotactique de cellules adhérentes mieux travailler avec immortalisé, de façon homogène les cellules distribuées, mais sont plus difficiles à appliquer à certaines cultures primaires de cellules souches qui n'ont pas d'abord une distribution homogène et rapide de différencier (comme CNC). Une approche pour homogénéiser la répartition de la CNE du tronc pour les études de chimiotactisme est d'isoler les CNC du tronc de l'enseignement primaire des cultures d'explants NT, puis soulevez et replate qu'ils soient près de 100% de confluence. Cependant, cette approche nécessite plaquage des quantités substantielles de temps et d'effort pour explant suffisamment de cellules, est rude, et distribue des CCN du tronc d'une manière différente à celle trouvée dans des conditions in vivo.

Nous rapportons ici une approche in vitro, qui est en mesure d'évaluer la chimiotaxie et d'autres réponses migratoires des CNC tronc sans requirindistribution de ga cellulaire homogène. Cette technique utilise imagerie time-lapse du primaire, imperturbable CNC tronc intérieur d'une chambre modifiés Zigmond (une chambre standard de Zigmond est décrit ailleurs ^10). En exposant CNC tronc à la périphérie de la culture à un gradient de chemotactant qui est perpendiculaire à leur directivité naturelle prédit, des altérations de la polarité migratoires induits par le gradient chemotactant appliquée peut être détecté. Cette technique est peu coûteuse, nécessite la mise en culture d'explants NT seulement deux pour le traitement de reproduire, de levage évite de cellules dures (telles que la trypsine), laisse les CNC malle dans une distribution plus semblable à des conditions in vivo, réduit la quantité de temps entre l'explantation et l'expérimentation (ce qui réduit probablement le risque de différenciation), et permet time-lapse d'évaluation des caractéristiques de nombreux migrateurs.

Protocol

1. Jour 1: Isolement des tubes du tronc de neurones pour une nuit de culture sur des lamelles

1. Oeufs chiches Incuber 56 h à 38 ° C. Retirer les oeufs de l'incubation, les pulvériser légèrement à l'éthanol 70%, puis laissez-les sécher. Casser les oeufs s'ouvrent sur un plateau en verre stérilisée aux UV.
2. Extrait chaque embryon de son jaune d'oeuf et le placer dans chiches Ringer. Pour ce faire, la première coupe autour de ses îles de sang avec des ciseaux courbes, puis, avec une pince émoussée, choisissez l'embryon par sa membrane extra-embryonnaires et le placer dans une boîte de Pétri stérile en plastique contenant une solution de Ringer chiches.....

Discussion

La réalisation de recherches chimiotaxiques sur les CCN du tronc s’est avérée difficile pour une série de raisons. Les CCN du tronc constituent une population hétérogène de cellules souches qui se différenciera si elles sont cultivées à long terme ; Les méthodes conventionnelles pour étudier la réponse chimiotactique de populations cellulaires distribuées de manière homogène in vitro sont difficiles à tester sur des NCC du tronc car elles nécessitent d’abord que les cellules soient isolées et replaquées de maniè.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Pénicilline Streptomycine Solution	Omega Scientific	PS-20	100X Stock Concentration
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	100X Stock Concentration
Fetal Bovin Serum	Omega	Scientific FB-11	Lot# 105247 (ou un autre qui est comparable)
Chambre Zigmond modifiée	Fait maison	N/A	Volume du réservoir : ~ 160 &mu ; l ea ; pour des spécifications supplémentaires, voir la Fig. 4 et le protocole de fabrication supplémentaire
Boîte de culture cellulaire	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectine	BD	354008	10X Stock préparé en diluant 1 mg de FN dans 1 ml de H2O et 9 ml
de lamelles	Fisher	12-548-B	Prénettoyé ; 22 x 22 mm
L15 moyen	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100 %
Tube à centrifuger	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentration
Seringue	BD	309602	1 ml
Aiguille	BD	305127	25 G x 1,5 po.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stock est de 2 mg/ml ; 7 moles colorant/mole
Pince de dissection	IgM FST	Misc.Dumont	#5 ou 55 ; à pointe droite ; acier inoxydable ou titane
Aiguille en tungstène	N/A	N/A	Fait maison ; placée dans un porte-goupille
Pince émoussée	Tiemann	160-18	Utilisée pour le transfert d’embryons à Ringer’s à partir du jaune d’œuf
Protocole supplémentaire : Fabrication d’une chambre Zigmond modifiée
Veuillez vous référer à la figure 4 comme référence pour le protocole ci-dessous :
Achetez une feuille d’acrylique poli de 3/16 » d’épaisseur (4,45 mm d’épaisseur réelle). À l’aide d’une scie à table, Découpez des ébauches de chambre surdimensionnées aux dimensions approximatives de 33,25 mm x 64,57 mm. Cela permet d’ajouter 3,175 mm de matière supplémentaire pour l’usinage. Réglez l’ébauche de la chambre sur un étau. À l’aide d’une fraiseuse et d’une fraise en bout de 6,35 mm (1/4"), terminez l’usinage des côtés de la chambre à leurs dimensions exactes : 30,07 mm x 61,39 mm. Positionnez l’ébauche de la chambre sur la fraiseuse et localisez le centre de l’ébauche le long des axes x et y à l’aide d’un détecteur de bord ; puis mettez à zéro l’emplacement central. Acquérez la hauteur de la chambre (axe z) en touchant la fraise sur la surface supérieure et mettez à zéro la hauteur. À l’aide d’une mèche de fraise de 3,91 mm (0,154"), décalez la mèche de 3,03 mm le long de l’axe x (direction positive) pour le premier réservoir. Commencez l’usinage dans la chambre jusqu’à une profondeur de 2,84 mm tout en vous déplaçant le long de l’axe y (direction positive) jusqu’à 7,62 mm (0,300 »), puis traversez jusqu’à 7,62 mm (0,300 ») dans la direction opposée (négative) jusqu’à une longueur complète de réservoir de 15,24 mm (0,600 »). Décalez le foret de 3,03 mm (0,119 po) le long de l’axe des x (direction négative) et répétez le même processus pour le deuxième réservoir. Positionnez la chambre sur son bord et percez un trou à l’aide d’un foret de 1,09 mm (0,043 po) à l’extrémité de chaque réservoir (4 au total) qui relie l’extrémité du réservoir au côté de la chambre pour charger le fluide pendant l’expérimentation. Faites bien tremper la chambre dans de l’eau chaude savonneuse pour aider à éliminer tous les contaminants chimiques. Faites tremper et rincez bien la chambre dans de l’eau doublement distillée pour éliminer tout savon. Les chambres sont maintenant prêtes à l’emploi comme décrit ci-dessus.