Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Résumé

Nous décrivons une approche alternative à l'énumération des mycobactéries In vitro, Qui utilise reporter-gènes marqués mycobactéries au lieu d'unités formant colonie (UFC). «Survie» des organismes ainsi que réponse de l'hôte-marqueurs sont mesurés simultanément, offrant un faible coût, un système polyvalent et fonctionnel pour les études de l'hôte / pathogène interactions dans le contexte de la tuberculose.

Résumé

Tests fonctionnels ont longtemps joué un rôle clé dans la mesure de l'immunogénicité d'un vaccin donné. Ceci est classiquement exprimée que le sérum des titres bactéricides. Etudes de sérum titres bactéricides en réponse aux vaccins infantiles ont permis de développer et valider de coupure niveaux pour des réponses immunitaires protectrices et de tels seuils sont utilisés en routine. Pas de tels dosages ont été prises vers l'avant dans l'évaluation de routine des vaccins qui induisent surtout immunité à médiation cellulaire sous la forme de réponses des lymphocytes T effecteurs, tels que les vaccins contre la tuberculose. Dans le modèle animal, la performance d'un candidat vaccin donné est systématiquement évaluée dans des essais standardisés bactéricides, et tous les courants roman TB-vaccins candidats ont été soumis à cette étape dans leur évaluation préalable à la phase 1 des essais humains. L'évaluation de l'immunogénicité et donc la probabilité de l'efficacité protectrice du roman de vaccins anti-tuberculeux devraient idéalement subir une similaires par étapes d'évaluation dans les modèles humains aujourd'hui, y compris des mesures dans les essais bactéricides.

Dosages bactéricides dans le cadre de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose sont déjà bien établies dans les modèles animaux, où ils sont appliqués à l'écran des vaccins candidats potentiellement prometteuse. Réduction de la charge bactérienne dans les fonctions de divers organes comme la principale lecture de l'immunogénicité. Cependant, aucune de tels dosages ont été incorporées dans les essais cliniques pour de nouveaux vaccins anti-tuberculeux à ce jour.

Bien qu'il reste encore une incertitude sur les mécanismes exacts qui conduisent à la mort de mycobactéries dans les macrophages humains, l'interaction des macrophages et des cellules T avec des mycobactéries est clairement nécessaire. L'essai décrit dans ce document représente une nouvelle génération de dosages bactéricides qui permet des études sur ces principaux composants cellulaires avec tous les autres facteurs cellulaires et humorales présents dans le sang total, sans faire des hypothèses sur leur contribution individuelle relative. Le dosage décrit par notre groupe utilise de faibles volumes de sang total et a déjà été employée dans les études sur les adultes et les enfants dans les paramètres de la tuberculose est endémique. Nous avons montré l'immunogénicité du vaccin BCG, l'augmentation de la croissance des mycobactéries dans les patients séropositifs, ainsi que l'effet de la thérapie anti-rétrovirale et la vitamine D sur la survie des mycobactéries in vitro. Nous résumons ici la méthodologie, et de présenter nos données de reproductibilité en utilisant ce modèle relativement simple, peu coûteuse et conviviale sur le terrain.

Remarque: Définitions / Abréviations

BCG lux = M. bovis BCG, la souche de Montréal, transformé avec pSMT1 plasmide navette transportant les gènes luxAB de Vibrio harveyi, sous le contrôle de l'origine mycobactérienne GroEL (hsp60) promoteur.
Unité UFC = Colony Forming (une mesure de la viabilité à mycobactéries).

Protocole

1. Préparation de stock BCG journaliste Lux mycobactéries

1. Cultivez le BCG lux (M. bovis BCG Montréal souche transformée avec le plasmide navette pSMT1) avec agitation à 200rpm à la mi-logarithmique de phase dans le bouillon Middlebrook 7H9 contenant 0,2% de glycérol, 0,05% tween 80 et 10% d'enrichissement ADC.
2. Préparer 1 ml d'une dilution 1:10 de BCG Lux culture dans du PBS stérile dans un tube à luminomètre (900μl de PBS + 100 ul BCG Lux culture), en double exemplaire.
3. Chargez le tube contenant du N-décyle aldéhyde (substrat de l'enzyme luciférase) sur le dos de la machine et s'assurer que le couvercle est sécurisé et les tubes en place.
4. Premier luminomètre injecteur avec substrat par l'intermédiaire du programme Prime, mis à injecter 100 UCL x 3 dans chacun des trois tubes vides d'amorçage placés dans le luminomètre.
5. Chargez les 2 tubes dans le luminomètre et prendre des lectures à travers un programme fixé à l'injection de 100 UCL de substrat dans chaque tube et lire pendant 20 sec dans des intervalles de 1 sec.
6. Lorsque le stock a atteint 1x10 ⁸ RLU / ml à 2x10 ⁸ RLU / ml (cela prend environ 3-4 jours de croissance), ajouter un volume égal de glycérol 30% stérile à la culture dans un tube 50ml Falcon et mélanger délicatement.
7. Aliquoter 1.5ml volumes dans 2ml étiquetés à bouchon à vis microtube et stocker à -80 ° C.

2. Déterminer des stocks RLU / UFC de corrélation et le contenu des aliquotes

1. Ajouter 15 ml de milieu Middlebrook 7H9 la culture avec supplément ADC 10% à un erlenmeyer 200ml avec un bouchon à évent.
2. Ajouter 15μl d'hygromycine et 30μl de Tween 20%.
3. Retirer un flacon de BCG Lux du congélateur et décongeler à température ambiante (TA) dans l'armoire de sécurité. Ajouter le contenu du flacon sur le support et serrer le bouchon.
4. Incuber sous agitation à 200rpm à 37 ° C pendant 4 jours.
5. Chaque jour, maquillage série 10 dilutions (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 et 1:100.000) pour la détermination UFC.
6. Mettre en place les mêmes dilutions en parallèle et en double pour déterminer la luminescence (voir partie 1.2 à 1.6).
7. Préparer deux plaques à 3 compartiments de Middlebrook 7H11 agar (1 l de milieu liquide contenant du glycérol 0,5%, 10% de supplément OADC, 1 ml de Tween 20% et 1 ml d'hygromycine).
8. Plaque à 100 ul de chaque dilution sur un segment de chaque plaque à l'aide épandeurs séparée, en distribuant le liquide de manière égale entre la chambre individuelle.
9. Sceau de chaque plaque avec du parafilm, placer dans un sac en plastique stérile, sceller avec du ruban autoclave, et incuber à 37 ° C pendant 2 semaines avec des couvercles vers le bas.
10. Inspectez régulièrement jusqu'à UFC apparaissent (2-3 semaines).
11. Pour compter les colonies, enlever les plaques de l'incubateur et le placer sur un compteur de colonies. Calculer la moyenne pour chaque dilution des plaques en double.
12. Calculer le rapport RLU / UFC aide équivalente RLU et UFC pour chaque dilution. Le ratio devrait se situer entre 3 et 5 RLU / UFC.

3. Préparation du BCG Lux culture pour l'inoculation dans le sang total

1. Ajouter 15 ml de milieu Middlebrook 7H9 la culture avec supplément ADC 10% à un erlenmeyer 200ml avec un bouchon à évent.
2. Ajouter 15μl d'hygromycine et 30μl de Tween 20%.
3. Retirer un flacon de BCG Lux du congélateur et décongeler à température ambiante dans l'enceinte de sécurité. Ajouter le contenu du flacon sur le support et serrer le bouchon.
4. Incuber sous agitation à 200rpm à 37 ° C pendant 2 à 4 jours.
5. Préparer 1 ml d'une dilution 1:10 de BCG Lux culture dans du PBS stérile dans un tube à luminomètre (900μl de PBS + 100 ul BCG Lux culture), en double exemplaire.
6. Luminomètre premier avec le substrat (comme décrit ci-dessus), agiter doucement au vortex les 2 tubes et charger dans le luminomètre et prendre des lectures (comme décrit ci-dessus).
7. Utilisez cette lecture afin de diluer le bas de la culture dans du PBS pour donner un équivalent de 7x10 ⁶ RLU (cela donne un inoculum d'environ 2x10 ⁵ UFC / ml de sang et un ratio de BCG pour les monocytes d'environ 1:1, en ​​supposant un nombre de monocytes du A propos de 2x10 ⁵ à 4x10 ⁵ monocytes par ml de sang).

4. Préparation de sang total

1. Prendre 3 à 5 ml de sang veineux dans un tube contenant de l'héparine sans conservateur.
2. Transfert du sang dans un tube de 50ml Falcon et diluer avec un volume égal de milieu RPMI 1640 contenant HEPES glutamine et 25 mm (sans stylet / STREP).
3. 900μl aliquote de sang diluée dans des tubes en triple Bijou stérile pour chaque point dans le temps (6 tubes au total: 3. 0hrs pour et 3 pour 96h Mettre en place des tubes supplémentaires pour timepoints supplémentaires, si nécessaire.
4. 900μl de milieu Aliquoter Middlebrooks la culture 7H9 avec 10% ADC complément hygromycine + 50μg/ml (le même milieu que celui utilisé pour la culture du BCG lux) en double pour les contrôles de croissance.
5. Ajouter 100 pi de l'diluée BCG lux à chaque tube de sang, et à la lutte contre une croissance de 2tubes.
6. Mélangez bien et placez les 3 bijous pour le 96h de temps-point et les deux contrôles de la croissance de leur côté dans l'incubateur à bascule à 37 ° C, 20 tr / min (CO ₂ n'est pas nécessaire).

5. Luminescence de mesure (à 0 HEURES et 96h)

1. Centrifuger les trois bijous à 2000g pendant 10 min.
2. Retirez délicatement 300μl de surnageant sans perturber le culot et le placer dans 2ml bouchon à vis Microtubes à geler à -80 ° C pour l'analyse des cytokines suivantes.
3. Ajouter 300μl de PBS dans chaque bijou pour remplacer le volume de surnageant retiré.
4. Aspirer le contenu de chaque bijou dans le tube 50ml Falcon correspondante et ajouter 8ml eau distillée à chaque tube. Commencez une minuterie de 10 min.
   NB: Ceci est une étape sensible au temps, et cette incubation ne doit pas être une de plus de 10 min, à partir de quand les cellules entrent les premiers en contact avec l'eau.
5. Rincer chaque bijou avec 2 ml d'eau distillée et vortex pendant 5 secondes avant de basculer dans le tube correspondant faucon.
6. A la fin de l'incubation de 10 minutes, centrifuger les tubes Falcon à 2000g pendant 10 minutes.
7. Décanter le surnageant en désinfectant Surfanios.
8. Ajouter quelques perles de verre à chaque boulette et le vortex.
9. Ajouter 1ml de PBS stérile dans chaque tube et le vortex.
10. Dans les tubes luminomètre, faire des dilutions de 1:10 pour chaque échantillon en double avec du PBS (PBS 900μl échantillon + 100 ul) et au temps de 96h-point. Faire les dilutions de même pour chacun des contrôles de croissance.
11. Vortexer doucement les tubes et les charger dans le luminomètre et prendre des lectures (comme décrit ci-dessus)
    Nb: Lectures entre les triplets de l'échantillon devrait être la même dans les 15% d'une autre.

6. Les résultats représentatifs:

Il est important d'utiliser des bactéries en phase logarithmique de croissance pour l'ensemble des dosages sanguins lux, soit augmenté au cours 48-72 heures avant l'inoculation des échantillons, que l'activité métabolique n'est pas optimale si l'une des droites du congélateur ou dans la phase stationnaire. La croissance préalable devrait être standardisé pour une série d'expériences soit à 48 ou 72 heures pour éviter la variabilité. La figure 1 montre la courbe de croissance d'une culture de représentant du BCG lux. Le temps de doublement est d'environ 24 heures jusqu'à la phase stationnaire est atteint.

Figure 1. Courbe de croissance représentant du BCG lux pendant 96 heures dans un milieu 7H9 et la corrélation des RLU et UFC.

Bien que les valeurs RLU toujours en corrélation avec UFC, le nombre de RLU correspond à une seule UFC peut varier en fonction du stock, ce qui explique pourquoi il est recommandé d'utiliser le même stock congelé à travers une série d'expériences afin de garantir une multiplicité cohérente de l'infection ( MOI).

Le tableau 1 montre un exemple de date brute au moment de l'inoculation (T ₀₎ et à 96 heures. Les ratios de croissance sont calculés selon la formule T ₉₆ / T _0, mais d'autres intervalles de temps peuvent bien sûr également être mesurée. Il est toutefois conseillé de ne pas utiliser les cultures au-delà de 96 heures, comme la mort cellulaire significative survient.

Tableau 1. Exemple de données brutes au moment de l'inoculation (T0) et à 96 heures (T96) et des ratios de croissance calculé à partir de 3 donneurs adultes.

Selon les réponses spécifiques de l'antigène de la mémoire disponible et compter peut-être aussi des neutrophiles, des ratios de croissance varient selon les individus, comme montré ici dans la figure 2 dans le sang des enfants avec et sans infection par le VIH. En moyenne, les jeunes enfants ont des ratios de croissance plus élevés que les adultes, le test cutané à la tuberculine (TCT) + les individus ont des ratios avez de croissance inférieur à TST-ve individus, et les patients infectés ont des ratios de croissance élevé en raison de la carence de la population de lymphocytes T CD4, l'un des médiateurs clés de la réponse immunitaire cellulaire aux mycobactéries.

Figure 2 Inter-bailleurs variabilité:. Ratios de croissance de T ₀ versus 96 heures pour un ensemble de patients, selon le statut VIH sous-jacente.

La reproductibilité des ratios de croissance sur une période de temps est montré dans la figure 3, qui résume les résultats de 64 donateurs saigné deux fois sur une période de 12 mois et d'un seul donneur saigné à plusieurs reprises pour des expériences de contrôle. Les causes potentielles de la variabilité pourrait être des changements dans la sensibilisation à mycobactéries ou de la variabilité dans les niveaux de cytokines hôte, comme observé dans les essais biologiques de nombreuses.

Figure 3. (A) seul donateur à 12 reprises en 12 mois. (B) plusieurs (64) les bailleurs de fonds à 2 reprises sur 12 mois.

Discussion

Dosages bactéricides dans le cadre de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose sont bien implantés dans des modèles animaux, où ils sont appliqués à l'écran des vaccins candidats potentiellement prometteuse. Réduction de la charge bactérienne dans les fonctions de divers organes comme la principale lecture de l'immunogénicité.

La première génération de tests bactéricides humains ont été conçus en utilisant les macrophages seul, infectés par M. tuberculose. UFC a se...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs	Société	Aucun chat
BCG Lux	Divers	n / a
Middlebrook 7H11 Agar	Becton Dickinson	283810
Le bouillon Middlebrook 7H9	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC enrichissement	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC complément	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma-Aldrich	274364
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5150
Hygromycine B	Roche	10843555001 (20ml)
N-décyle aldéhyde	Sigma	D7384-100G
L'éthanol (> 99,7%)	VWR	101077
PBS stérile	Dans Maison	n / a
RPMI-1640 avec L-Glutamine, HEPES 25mM	Sigma	R0883
L'eau distillée stérile	Dans Maison	n / a
Équipement
Luminomètre Tube (port injectable obligatoire)	Berthold LB953 AutoLumat ou mono-tube de luminomètre Sirius
Luminomètre tubes, 12 x 75mm, pyrex sans monture	Corning de VWR	99445-12
Erlenmeyer avec bouchon ventilé, stérile en polycarbonate 250ml	Corning via Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer tubes de prélèvement sanguin (sans conservateur héparine)	BD	367676
50ml tubes Falcon, conique	BD	352077
7ml Sterilin spécimen de polypropylène Bijou tubes	VWR	99445-12
Sterilin universelle des conteneurs (30 ml)	Laboratoire d'analyse LTD	128C
Les perles de verre de 2mm de diamètre	SigmaAldrich	Z143928
10ml pipettes et garçon pipette	toute
1000μl et 200 pl Pipettes et pointes à filtre	toute
Général du matériel de laboratoire:
Classe II de sécurité du cabinet du cabinet
Réfrigérateur (4 ° C)
Centrifugeuse
Rocking agitateur plateforme (180 0) à mélanger des tubes
Agitateur incubateur réglé à 37 ° C pour grandir cultures bactériennes