Nous décrivons une approche alternative à l'énumération des mycobactéries In vitro, Qui utilise reporter-gènes marqués mycobactéries au lieu d'unités formant colonie (UFC). «Survie» des organismes ainsi que réponse de l'hôte-marqueurs sont mesurés simultanément, offrant un faible coût, un système polyvalent et fonctionnel pour les études de l'hôte / pathogène interactions dans le contexte de la tuberculose.
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Article de méthode
Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)
Dans cet article
Résumé
Résumé
Tests fonctionnels ont longtemps joué un rôle clé dans la mesure de l'immunogénicité d'un vaccin donné. Ceci est classiquement exprimée que le sérum des titres bactéricides. Etudes de sérum titres bactéricides en réponse aux vaccins infantiles ont permis de développer et valider de coupure niveaux pour des réponses immunitaires protectrices et de tels seuils sont utilisés en routine. Pas de tels dosages ont été prises vers l'avant dans l'évaluation de routine des vaccins qui induisent surtout immunité à médiation cellulaire sous la forme de réponses des lymphocytes T effecteurs, tels que les vaccins contre la tuberculose. Dans le modèle animal, la performance d'un candidat vaccin donné est systématiquement évaluée dans des essais standardisés bactéricides, et tous les courants roman TB-vaccins candidats ont été soumis à cette étape dans leur évaluation préalable à la phase 1 des essais humains. L'évaluation de l'immunogénicité et donc la probabilité de l'efficacité protectrice du roman de vaccins anti-tuberculeux devraient idéalement subir une similaires par étapes d'évaluation dans les modèles humains aujourd'hui, y compris des mesures dans les essais bactéricides.
Dosages bactéricides dans le cadre de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose sont déjà bien établies dans les modèles animaux, où ils sont appliqués à l'écran des vaccins candidats potentiellement prometteuse. Réduction de la charge bactérienne dans les fonctions de divers organes comme la principale lecture de l'immunogénicité. Cependant, aucune de tels dosages ont été incorporées dans les essais cliniques pour de nouveaux vaccins anti-tuberculeux à ce jour.
Bien qu'il reste encore une incertitude sur les mécanismes exacts qui conduisent à la mort de mycobactéries dans les macrophages humains, l'interaction des macrophages et des cellules T avec des mycobactéries est clairement nécessaire. L'essai décrit dans ce document représente une nouvelle génération de dosages bactéricides qui permet des études sur ces principaux composants cellulaires avec tous les autres facteurs cellulaires et humorales présents dans le sang total, sans faire des hypothèses sur leur contribution individuelle relative. Le dosage décrit par notre groupe utilise de faibles volumes de sang total et a déjà été employée dans les études sur les adultes et les enfants dans les paramètres de la tuberculose est endémique. Nous avons montré l'immunogénicité du vaccin BCG, l'augmentation de la croissance des mycobactéries dans les patients séropositifs, ainsi que l'effet de la thérapie anti-rétrovirale et la vitamine D sur la survie des mycobactéries in vitro. Nous résumons ici la méthodologie, et de présenter nos données de reproductibilité en utilisant ce modèle relativement simple, peu coûteuse et conviviale sur le terrain.
Remarque: Définitions / Abréviations
BCG lux = M. bovis BCG, la souche de Montréal, transformé avec pSMT1 plasmide navette transportant les gènes luxAB de Vibrio harveyi, sous le contrôle de l'origine mycobactérienne GroEL (hsp60) promoteur.
Unité UFC = Colony Forming (une mesure de la viabilité à mycobactéries).
Protocole
1. Préparation de stock BCG journaliste Lux mycobactéries
- Cultivez le BCG lux (M. bovis BCG Montréal souche transformée avec le plasmide navette pSMT1) avec agitation à 200rpm à la mi-logarithmique de phase dans le bouillon Middlebrook 7H9 contenant 0,2% de glycérol, 0,05% tween 80 et 10% d'enrichissement ADC.
- Préparer 1 ml d'une dilution 1:10 de BCG Lux culture dans du PBS stérile dans un tube à luminomètre (900μl de PBS + 100 ul BCG Lux culture), en double exemplaire.
- Chargez le tube contenant du N-décyle aldéhyde (substrat de l'enzyme luciférase) sur le dos de la machine et s'assurer que le couverc....
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Discussion
Dosages bactéricides dans le cadre de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose sont bien implantés dans des modèles animaux, où ils sont appliqués à l'écran des vaccins candidats potentiellement prometteuse. Réduction de la charge bactérienne dans les fonctions de divers organes comme la principale lecture de l'immunogénicité.
La première génération de tests bactéricides humains ont été conçus en utilisant les macrophages seul, infectés par M. tuberculose. UFC a se.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été financé par des bourses personnelles par le Wellcome Trust à Beate Kampmann (056608, GRO77273).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs | Société | Aucun chat | |
| BCG Lux | Divers | n / a | |
| Middlebrook 7H11 Agar | Becton Dickinson | 283810 | |
| Le bouillon Middlebrook 7H9 | BD Biosciences | 271310 (500g) | |
| Middlebrook ADC enrichissement | BD Biosciences | 212352 | |
| Middlebrook OADC complément | Becton Dickinson | 212240 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| Glycérol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Hygromycine B | Roche | 10843555001 (20ml) | |
| N-décyle aldéhyde | Sigma | D7384-100G | |
| L'éthanol (> 99,7%) | VWR | 101077 | |
| PBS stérile | Dans Maison | n / a | |
| RPMI-1640 avec L-Glutamine, HEPES 25mM | Sigma | R0883 | |
| L'eau distillée stérile | Dans Maison | n / a | |
| Équipement | |||
| Luminomètre Tube (port injectable obligatoire) | Berthold LB953 AutoLumat ou mono-tube de luminomètre Sirius | ||
| Luminomètre tubes, 12 x 75mm, pyrex sans monture | Corning de VWR | 99445-12 | |
| Erlenmeyer avec bouchon ventilé, stérile en polycarbonate 250ml | Corning via Fisher Scientific | 2150329 | |
| BD Vacutainer tubes de prélèvement sanguin (sans conservateur héparine) | BD | 367676 | |
| 50ml tubes Falcon, conique | BD | 352077 | |
| 7ml Sterilin spécimen de polypropylène Bijou tubes | VWR | 99445-12 | |
| Sterilin universelle des conteneurs (30 ml) | Laboratoire d'analyse LTD | 128C | |
| Les perles de verre de 2mm de diamètre | SigmaAldrich | Z143928 | |
| 10ml pipettes et garçon pipette | toute | ||
| 1000μl et 200 pl Pipettes et pointes à filtre | toute | ||
| Général du matériel de laboratoire: | |||
| Classe II de sécurité du cabinet du cabinet | |||
| Réfrigérateur (4 ° C) | |||
| Centrifugeuse | |||
| Rocking agitateur plateforme (180 0) à mélanger des tubes | |||
| Agitateur incubateur réglé à 37 ° C pour grandir cultures bactériennes |
Références
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B.
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Réimpressions et autorisations
