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Article de méthode

Une introduction à guêpes parasites

18.1K vues

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DOI :

10.3791/3347

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7 mai 2012

 ,  ,  , 
1Biology Department, The City College of New York, CUNY, 2The Graduate Center, The City University of New York

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Parasitoïde (parasite) guêpes constituent une classe importante des ennemis naturels des insectes, y compris de nombreux Drosophila melanogaster. Nous allons introduire les techniques de propager ces parasites dans les Drosophila Spp. et de démontrer la façon d'analyser leurs effets sur les tissus immunitaires de Drosophila Larves.

Résumé

La plupart des espèces connues de guêpes parasitoïdes attaquent les stades larvaires ou pupaux de Drosophila. Alors que Trichopria drosophilae infecte les stades pupaux de l'hôte (Fig. 1A-C), les femelles du genre Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) et de Ganaspis (Fig. 1E) s'attaquent aux stades larvaires. Nous utilisons ces parasites pour étudier la base moléculaire d'une course aux armements biologique. Les guêpes parasitoïdes présentent une grande valeur en tant qu'agents de lutte biologique. La plupart d'entre elles portent des facteurs de virulence et d'autres éléments qui modifient la physiologie et l'immunité de l'hôte. L'analyse des guêpes de Drosophila fournit des éclairages sur la manière dont les interactions spécifiques aux espèces façonnent la structure génétique des communautés naturelles. Ces études servent également de modèle pour comprendre la physiologie immunitaire des hôtes et la façon dont les réactions immunitaires coordonnées sont contrecarrées par cette classe de parasites.

La cuticule larvaire/pupale constitue la première ligne de défense. L’ovipositeur de la guêpe est une structure effilée en forme d’aiguille qui dépose efficacement les œufs dans l’hémocœle de l’hôte. L’oviposition est suivie d’une réaction de cicatrisation au niveau de la cuticule (Fig. 1C, flèches). Certaines guêpes peuvent introduire deux œufs ou plus dans un même hôte, bien que le développement d’un seul œuf aboutisse. Les œufs supplémentaires ou les larves en développement sont éliminés par un processus qui n’est pas encore compris. Ces guêpes sont donc qualifiées de parasitoïdes solitaires.

Selon la souche de drosophile et l'espèce de guêpe, l'œuf de guêpe connaît l'un des deux destin suivants : il est soit encapsulé, bloquant ainsi son développement (émergence de l'hôte ; Fig. 2 à gauche) ; soit l'œuf de guêpe éclos, se développe, mue et grandit jusqu'à devenir un adulte (émergence de la guêpe ; Fig. 2 à droite). L. heterotoma est l'une des espèces de guêpes parasitoïdes de Drosophila les plus étudiées. C'est une « généraliste », ce qui signifie qu'elle peut utiliser la plupart des espèces de Drosophila comme hôtes1. L. heterotoma et L. victoriae sont des espèces sœurs et produisent des particules semblables à des virus qui interfèrent activement avec la réponse d'encapsulation2. Contrairement à L. heterotoma, L. boulardi est un parasite spécialisé, dont l'éventail d'espèces de Drosophila utilisées comme hôtes est relativement restreint1. Les souches de L. boulardi produisent également des particules semblables à des virus3, bien qu'elles diffèrent fortement par leur capacité à réussir sur D. melanogaster1. Certaines de ces souches de L. boulardi sont difficiles à faire se développer sur D. melanogaster1, car l'hôte drosophile parvient fréquemment à encapsuler leurs œufs. Il est donc essentiel de connaître les caractéristiques des deux partenaires dans des protocoles expérimentaux spécifiques.

Outre les tissus de barrière (cuticule, tube digestif et trachée), les larves de Drosophila possèdent des réponses immunitaires cellulaires et humorales systémiques, provenant respectivement des fonctions des cellules sanguines et du corps adipeux. La ponte de L. boulardi active les deux voies immunitaires1,4. Les cellules sanguines se trouvent en circulation, dans des populations sessiles situées sous la cuticule segmentée, et dans la glande lymphoïde. La glande lymphoïde est un petit organe hématopoïétique situé sur la face dorsale de la larve. Des groupes de cellules hématopoïétiques, appelés lobes, sont disposés de manière segmentaire par paires le long du vaisseau dorsal qui s'étend selon l'axe antéro-postérieur de l'animal (Fig. 3A). Le corps adipeux est un organe volumineux aux multiples fonctions (Fig. 3B). Il sécrète des peptides antimicrobiens en réponse aux infections microbiennes et métazoaires.

L'infection par la guêpe active la signalisation immunitaire (Fig. 4)4. Au niveau cellulaire, elle déclenche la division et la différenciation des cellules sanguines. En guise d'autodéfense, des agrégats et des capsules se forment dans l'hémocœle des animaux infectés (Fig. 5)5,6. Les cellules sanguines activées migrent vers l'œuf de guêpe (ou la larve de guêpe) et commencent à former une capsule autour de celui-ci (Fig. 5A-F). Certaines cellules sanguines s'agrègent pour former des nodules (Fig. 5G-H). Une analyse minutieuse révèle que l'infection par la guêpe induit la dispersion des lobes les plus antérieurs de la glande lymphatique au niveau de leurs périphéries (Fig. 6C, D).

Nous présentons des données représentatives concernant les composants de la voie de transduction du signal Toll, Dorsal et Spätzle (Figs. 4,5,7), ainsi que son gène cible Drosomycin (Fig. 6), afin d'illustrer comment des modifications spécifiques dans la glande lymphoïde et l'hémocèle peuvent être étudiées après une infection par des guêpes. Les protocoles de dissection décrits ici permettent également d'isoler les œufs de guêpes (ou les stades en développement des guêpes) à partir de l'hémolymphe de l'hôte (Fig. 8).

Protocole

Le protocole complet pour l'expérience est divisée en quatre étapes (Fig. 9). Guêpes culture (1) sur les larves de mouches, (2) Mise en place d'infections et de préparer les animaux pour la dissection, (3) isolation et de fixation hôte / parasite structures; (4) Analyse de tissus immunitaires.

1. Guêpes culture sur larves de drosophile

Entretien des cultures de guêpes nécessite une planification minutieuse. Par rapport à la croissance des mouches, il est assez de main-d'œuvre. Nous maintenons nos colonies de guêpes dans le laboratoire sur des larves ou des pupes de la souche de Drosophila yw à 24 ° C. La culture de guêpes consiste à maintenir une source continue d'hôtes au stade de la droite et de compensation des «infectés» flacons de mouches qui émergent avant les guêpes faire. Guêpes suivre la méthode haplodiploïde de détermination du sexe et il est donc important que les femelles sont accouplées avant qu'ils n'infectent les hôtes.

  1. Au jour 1, ajouter une noisette de frais de pré-pâte de levure comparé (en mélangeant 1 ml d'eau à peu près 1 g de levure sèche active dans un flacon alimentaire mouche frais La recette de la nourriture volée n'est pas critique;. nous grandissons mouches sur le support corn-meal/sucrose/agar. Lieu 50-60 jeune (2-4 day-old) adulte yw (ou tout autre souche de type sauvage essentiellement) vole à pondre des œufs pendant 48 heures à 24 ° C.
  2. Au jour 3, supprimer les mouches des flacons. Placez un bouchon buzz sur le flacon avec une goutte de miel sur le côté intérieur de la fiche buzz. Le miel est dilué 2:1 dans de l'eau distillée.
  3. En utilisant le CO 2, anesthésier les guêpes et les trier 6-8 femelles et mâles 6-8 qui sont environ 2-3 jours. Ajoutez-les à la fiole contenant 0-48 heures hôtes anciennes. Notez que les guêpes sont plus sensibles au CO 2 que les mouches, et vous pourriez avoir à calibrer leur exposition au gaz. Chercheurs drosophile ne pas utiliser une conception standard Drosophila station de l'anesthésie. Un bon point de départ pour anesthésier les guêpes consiste à définir la pression de CO 2environ la moitié de ce qui est nécessaire pour les mouches d'anesthésie.
  4. Remettre le bouchon buzz (avec du miel) sur le flacon. Placez délicatement le flacon sur le côté jusqu'à ce que les guêpes se réveiller.
  5. Placez ces flacons avec des larves de mouches et de guêpes dans un incubateur à 24 ° C.
  6. Infections retenus seront retarder nymphose légèrement. Les hôtes qui ont subi une attaque de guêpes, mais sont capables de se défendre (ou si elles ne sont pas infectés), poursuivre le développement en suivant le calendrier normal et les mouches adultes émergent de ces pupes bien en avance sur les guêpes.
  7. Selon l'espèce de guêpe et de la température, les guêpes éclosent en 25-30 jours.
  8. Retirez les mouches adultes à partir des flacons dans lesquels les guêpes sont en voie de développement.

2. Mise en place d'infections et de préparer les animaux infectés pour la dissection

Avant de commencer, un couple de verre ou des boîtes de Pétri en plastique, un plat en pyrex de dissection avec 9 dépressions, Kimwipes, de l'eau distillée (dans une bouteille), 70% d'éthanol (dans une bouteille), du PBS 1X (dans une bouteille), des lames de microscope, et un petit, spatule propre à portée de main.

  1. Pour configurer les infections, suivez les étapes 1-5 ci-dessus. Selon l'expérience, il peut être nécessaire d'utiliser les hôtes qui sont à peu près au même stade de développement. Pour cela, egglays de 2-6 heures peut être utilisé pour l'infection.
  2. Pour récolter des larves infectées (pour les dissections de tissus immunitaires ou des parasites), supprimer le contenu des flacons de mouches dans un petit verre ou en plastique boîte de Pétri.
  3. L'utilisation d'un stéréomicroscope et une pince fine (pince à épiler), choisir soigneusement 6-10 larves, un par un et les placer dans une dépression bien avec du PBS 1X, puis les transférer dans l'eau, l'éthanol à 70%, l'eau et du PBS 1X, successivement. Le but de ces étapes est de libérer les animaux de la nourriture volée et nettoyer soigneusement et stériliser leur surface. Le rincer à l'eau dilue l'éthanol et le rinçage final dans du PBS élimine l'éthanol. Pour l'étape 3 ci-dessous, il est préférable de ne pas quitter leanimaux dans du PBS pour plus de 10 minutes.

3. L'isolement et de fixation hôte / parasite Ouvrages d'art

Fond

Le ganglion lymphatique larvaire est un 7 petit organe hématopoïétique. Au troisième stade larvaire, la glande lymphatique contient une grande paire de lobes antérieurs qui flanquent le vaisseau dorsal (Fig. 3A, 6B-C, 7A-D). Les lobes antérieurs sont divisés en régions spécialisées ayant des propriétés de cellules uniques 7. Progéniteurs de trois types de cellules, plasmatocytes lamellocytes et les cellules à cristaux résider dans les lobes antérieurs. Cellules péricardiques séparer les lobes antérieurs des petits lobes postérieurs. Le ganglion lymphatique chez la drosophile est un modèle pour l'hématopoïèse insectes et de mammifères 8,9.

De graisse corporelle est fonctionnellement identique au foie des mammifères. La réponse humorale est déclenchée dans le microbienne suivante de graisse corporelle ou 1,4,10 infection guêpe. CommeEn conséquence, une combinaison unique de gènes peptides antimicrobiens sont activés et les peptides sont sécrétés dans l'hémolymphe 1. La graisse corporelle est aussi le tissu primaire pour la production de glycogène et de triglycérides et de stockage 11. Le corps de la larve grasse occupe volume substantiel de l'hémocèle et, si différent de la glande lymphatique, il est facile à localiser. Nous allons maintenant démontrer comment disséquer la glande lymphatique et la graisse du corps d'un stade larvaire tiers.

Avant de commencer

Besoin d'une pince fine (pince à épiler) et l'éthanol nettoyés lames de microscope.

Larvaire dissection des ganglions lymphatiques

  1. En utilisant des pinces fines, sélectionnez une errance larve du troisième stade larvaire conservés dans du PBS 1X.
  2. Placez la larve sur une lame de microscope.
  3. En utilisant des pinces, placer l'animal avec la face ventrale vers le haut.
  4. L'utilisation de deux paires de pinces, tenir l'animal de chaque côté de l'extrémité postérieure (flèches 1, Fig. 3A) et gently tirez la cuticule d'introduire une petite déchirure superficielle de la cuticule.
  5. Le hémolymphe contenant hémocytes, l'intestin, et le corps gras commence à s'échapper de la cavité du corps. Le hémolymphe peut être pris avec un 10 ul "pipetteman" de faire des frottis, si nécessaire.
  6. Placer les deux pinces sur le côté droit de l'animal sous les crochets buccaux (pointes de flèche 2, Fig. 3A), délicatement arracher la cuticule.
  7. Déplacez les deux pinces sur le côté gauche de l'animal sous les crochets buccaux (pointes de flèche 2, Fig. 3A) et soigneusement faire une autre petite déchirure.
  8. Tout en maintenant la bouche des crochets de l'animal, tirez doucement sur la cuticule vers le bas vers l'extrémité postérieure de l'animal (comme si elle éplucher).
  9. Comme la cuticule est tiré vers l'arrière, le cerveau, le corps gras, les disques imaginaux, glandes salivaires, et le proventricule deviendra exposés. La cuticule est maintenant détaché à l'extrémité postérieure, mais auront toujours le vaisseau dorsal avec la glande lymphatique qui s'y rattachent.
  10. Couper le proventricule et l'éloigner de la région de la glande lymphatique. Le ganglion lymphatique sera sous le cerveau, même si vous ne pouvez pas être en mesure de le voir.
  11. Soigneusement taquiner l'écart de la graisse corporelle, de l'intestin, les glandes salivaires, et d'autres structures qui peuvent être assis sur la glande. Soyez prudent de ne pas détacher la glande lymphatique de la glande anneau et le vaisseau dorsal situé postérieure du cerveau. Le ganglion lymphatique sera positionné à plat contre la lame de microscope.
  12. Retirez soigneusement tous les tissus supplémentaires loin de la glande lymphatique jusqu'à ce que la glande entière se déroule dans les lobes antérieurs à la dernière série de cellules péricardiques.

Remarque: Un ganglion lymphatique bien disséqué aura une paire de lobes antérieurs et deux ensembles de lobes postérieurs long du vaisseau dorsal (Fig. 6B). Les lobes peuvent être facilement endommagés ou peuvent tomber à partir du vaisseau dorsal. Les échantillons doivent donc être manipulés avec grand soin. La glande aussi hcomme une tendance à se recroqueviller ou d'un contrat. Doucement redresser l'organe à son extrémité postérieure permet à toutes les parties et les cellules doit être présenté ainsi. Cela est particulièrement nécessaire pour les protocoles immunocoloration.

La dissection du corps Fay

  1. Sur la scène de dissection de l'Zeiss 1000 microscope à dissection (n'importe quelle source stéréo microscope à dissection peut être utilisé), placez une zone de lumière qui permet à la lumière incidente d'être transmise à travers l'échantillon. Placez une larve du troisième stade larvaire de l'étape 2 sur une lame de microscope dans 200 ul de PBS 1X. Inclinez la source de lumière loin de l'échantillon de telle sorte que l'organisme semble transparente et donc il est facile de visualiser ses organes internes.
  2. En utilisant le forceps, la position de l'animal de telle sorte que l'extrémité antérieure est loin de vous.
  3. En utilisant le forceps, maintenez la cuticule de la larve sur le côté gauche de ses crochets buccaux (flèche 1, Fig. 3B). Utilisation de la pince d'autres, légèrement déchirer la cuticule tout le chemin à l'extrémité postérieure (arrowhead 2, figure 3B). Ne déchirez pas la cuticule du corps à l'extrémité postérieure.
  4. Très doucement commencer à enlever l'intestin d'un côté.
  5. Retirez délicatement le cerveau, les disques imaginaux, et la glande ring avec la glande lymphatique qui traverse le vaisseau dorsal.
  6. Ne pas enlever les glandes salivaires car il ya de graisse corporelle adhérant à ces glandes.
  7. Retirez délicatement la cuticule et de laisser le corps gras sur la diapositive dans du PBS 1X.

Note 1: La graisse corporelle a une seule couche de cellules et il est donc important d'avoir toutes les cellules aplaties dans le même plan sur la lame de verre. Les cellules sont endopolyploid et facile à visualiser. Un échantillon corporel bien-disséqué matières grasses devrait maintenir des contacts cellulaires normales, et devrait avoir un minimum de globules gras autour de l'échantillon (Fig. 6I disséqué, J).

Note 2: Si les œufs de guêpes ne sont pas affectées par le système immunitaire de l'hôte, ils seront initiatdéveloppement de l'e presque immédiatement. Les premières étapes du développement du parasite (de la larve hôte) sont facilement accessibles depuis l'hémocèle disséqué (fig. 8). Œufs de parasites ou de larves, soit adhérer à la graisse du corps ou d'autres organes, ou tout simplement glisser sur la lame de verre lors de la dissection.

4. Analyse tissus immunitaires

  1. Glandes lymphatiques Air sec pour 5-10 min et supprimer du PBS 1X à partir de la diapositive de graisse du corps avant de fixer pendant 5-10 minutes avec du paraformaldéhyde 4% préparée dans du PBS. Chaque diapositive peut avoir plusieurs ganglions lymphatiques disséqués pour la coloration. Déplacer des diapositives avec des échantillons fixes dans une chambre de maison humidifié pour des étapes ultérieures. Cette chambre est préparé en plaçant deux morceaux de pliées, serviettes en papier humides au fond d'une boîte embout en plastique micropipette vide. Un ou plusieurs lames avec des échantillons peuvent être placés sur le dessus du diviseur utilisé pour maintenir les pointes.
  2. En tant que tel, l'analyse des tissus immunitaires se fait suivant des méthodes standardse combinent dans l'étiquetage des cellules in vivo et 4 immunohistochimie indirecte.

5. Les résultats représentatifs

  1. L'infection Wasp active l'expression du journaliste voie Toll drosomycine-GFP (Fig. 6G, J). Dans cette expérience, l'effet de guêpe-infestation sur l'expression génique est visualisée in vivo utilisant un GFP-journaliste lié au promoteur Drs 12. Chez les animaux témoins non infectés, l'expression de la GFP n'est pas détecté. Le signal de la GFP est clairement détecté dans le cytoplasme et le noyau des cellules de la graisse corporelle, disséqué d'animaux infectés par L. victoriae. Pour obtenir les meilleurs résultats, le rapport de guêpes: les hôtes doivent être 1:10. L'infection devrait durer au moins 2 heures. Infestation Post, les signaux s'intensifie Drs-GFP et de nombreuses cellules de graisse du corps sont GFP-positives, même jusqu'à 72 heures 1,4.
  2. L'infection induit la différenciation des Wasp lamellocytes dans le lglande ymph (fig. 6D). Lamellocytes entourent et de bloquer le développement de guêpe (Fig. 6H). Les ganglions lymphatiques sont disséqués pour visualiser les changements cellulaires induits dans les lobes antérieurs après L. victoriae infection. Nouvellement différenciés lamellocytes sont présents à la périphérie des lobes disséqués; lamellocytes sont marqués d'un transgène GFP qui est entraînée par le difforme enhancer (MSNF9-GFP). Toutes les cellules sont visualisées avec l'actine filamenteuse à l'aide marqué à la rhodamine phalloïdine. Notez que l'intégrité des lobes antérieurs est perturbée dans ces glandes comme la membrane basale qui entoure normalement le lobe en continu (Fig. 6C), est maintenant discontinue (Fig. 6D). D'après les dissections mêmes, lamellocytes dans l'hémolymphe peuvent également être visualisées dans les frottis (Fig. 6G); dont certains sont associés à la structure de la capsule formée de bloquer le développement du parasite (fig. 6H).
  3. Sprotéines pätzle est exprimé dans la plupart des cellules de la glande lymphatique larvaire (Fig. 7C, D). Pour détecter Spz dans les glandes lymphatiques disséqués, nous avons suivi un protocole standard pour la coloration des cellules de la glande lymphatique avec des anticorps polyclonaux anti-SPZ anticorps 4. In vivo, l'augmentation des niveaux Spz dans les cellules des glandes lymphatiques après l'infection de guêpe (comparer les panneaux Fig. 7C, E avec 7G, I, et 7D panneaux, F avec 7H, J).
  4. Stades précoces et tardifs de développement de larves de guêpe hôte et pupes (fig. 8). Pour examiner les stades de développement de guêpes, les larves infectées sont disséqués à divers moments après la ponte. Ici, nous montrons un échantillon de ces étapes, de la Leptopilina spp. De type sauvage infecté D. melanogaster héberge.

Figure 1
Figure 1. Différentes espèces de guêpes et de ponte de l'œuf de guêpe. Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'un stéréomicroscope Leica. Une guêpe femelle pond drosophilae Trichopria œuf dans un D. melanogaster nymphe. Grossissement B de la ponte de la drosophile en Trichopria accueil taches nymphe C. mélanisées indiquent la cicatrisation des plaies sur le site de ponte. D L. boulardi masculine. E G. xanthopoda femme. F L. femme victoriae. G L. heterotoma mâle (à gauche) et femelle.

Figure 2
Figure 2. Les cycles de vie montrant la course à la mouche / guêpe bras. Résultats de ponte dans l'un des deux résultats. Réactions de l'hôte soit immunitaires réussir à bloquer le développement de la guêpe (à gauche), ou la guêpe contrecarre immunitaire de l'hôte RespoNSE et réussit (à droite). Mise à jour de Melk et de Govind, 1999 18.

Figure 3
Figure 3. Troisième stade larvaire montrant les organes d'intérêt avant la dissection. Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'un stéréomicroscope Leica. Une Hml> GFP larve avec la GFP (green) de fluorescence (flèche) dans des cellules individuelles de la glande lymphatique indique l'emplacement général de la glande lymphatique chez un animal intacte. La larve a été imagées avec optique en champ de fluorescence et lumineux. Pointes de flèches indiquent les endroits importants pour le protocole curage ganglionnaire glande décrite dans le texte. B Cg> GFP larve avec expression de la GFP dans le corps gras pour indiquer l'emplacement de l'orgue dans une anim intacteAl. Pointes de flèches indiquent les endroits importants pour le protocole de dissection de graisse du corps décrite dans le texte.

Figure 4
Figure 4. Immuno-génétique circuit de la réponse immunitaire de l'hôte contre les composants de base de parasitoïdes attaque. De la voie Toll sont présentés. Spätzle (SPZ) est activé par l'enzyme protéase de traitement Spätzle, SPE. Activated Spz sert de ligand pour Toll. Signalisation intracellulaire conduit à l'activation de facteurs de transcription NF-kB, les dorsaux et Dif. Cactus sert l'inhibiteur IkB de la voie. L'activation de la drosomycine, un gène sans canonique voie cible, peut être contrôlé en utilisant des souches de mouches transgéniques avec le rapporteur GFP (voir Fig. 6I, J).

Figure 5
Figure 5. Encapsulation en réponse à L. infestation victoriae dansSerpent> GFP-dl hôtes Drosophila. Un enhancer du gène Serpent est exprimée en 13 cellules sanguines. Lorsque cet enhancer entraîne l'expression de la protéine de fusion GFP-dorsale dans un transgène, dorsale est détectée via la fluorescence verte de la GFP dans certains plasmatocytes et lamellocytes qui composent les capsules et les agrégats. Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM. Un oeuf de L. grossissements victoriae. lamellocytes BD (flèches blanches) à l'extrémité postérieure de l'express oeuf GFP-dorsale. CD plus élevés de l'échantillon dans le panneau B. EH échantillons sont contre-marqué à la rhodamine phalloïdine pour visualiser l'actine filamenteuse (F-actine, rouge) et avec Hoechst 33258 pour visualiser l'ADN (bleu). E encapsulé œuf de L. victoriae. F capsule mélanisée de L. victoriae. GH L. victoriae infection induit des cellules du sang (plasmatocyte et lamellocyte) l'agrégation.

Figure 6
Figure 6. Les réponses immunitaires contre les infections guêpe. Images dans les panneaux A et B ont été obtenues à l'aide d'une étendue Zeiss Axio. Images dans les panneaux CJ ont été obtenus en utilisant un microscope confocal Zeiss LSM. Une larve hôte montrant mélanisée oeuf de guêpe encapsulé (tête de flèche) à travers la cuticule transparente. B représentant la glande lymphatique troisième stade larvaire colorées avec Hoechst 33258 révèle des cellules de tous les lobes et entrecoupées cellules péricardiques. La barre d'échelle représente 100 μ. CJ Tous les échantillons ont été contre-colorées avec Hoechst 33258 (à noyaux étiquette) et la rhodamine phalloïdine (pour étiqueter F-actine). CD lobes antérieurs des glandes lymphatiques de contrôle (C) et L. victoriae-infectés (D) MSNF9-GFP animaux. Chez les animaux infectés, MSNF enhancer expression, spécifiques à lamellocytes 14, est détectée avec un rapporteur GFP nucléaire. plasmatocytes E isolés chez des animaux non infectés ne pas exprimer la GFP. Ces animaux ont très peu ou pas de lamellocytes. F plasmatocytes (GFP-négative, flèche courte) et nouvellement différenciés, lamellocytes grandes (flèches longues) avec expression de la GFP nucléaire faible de L. victoriae-infecté MSNF9-GFP larve. plasmatocytes G libres et agrégée et lamellocytes de la hémocèle d'un L. victoriae-infecté Drs-GFP larve. L'expression de la journaliste Drs-GFP est activée dans certains plasmatocytes (flèche courte), mais pas dans lamellocytes (flèches longues) post-infection. H encapsulé et larve de guêpe mélanisée de L. boulardi-infectés larve hôte MSNF9-GFP. De nombreux MSNF9-GFP-positives lamelloctyes entourent la larve de guêpe (structure sombre; flèche épaisse) et présentent une forte expression de la GFP nucléaire (flèches longues). Ce panel déjà publié dans la revue PLoS One 15. cellules de graisse du corps disséqué IJ de non infecté (I) et L. victoriae-infecté (J) Drs-GFP larve. GFP est nucléaire et cytoplasmique dans les cellules de graisse du corps des animaux infectés. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 7
Figure 7. Expression Spätzle après l'infection guêpe parasitoïde. Échantillons ont été contre-AJ avec Hoechst 33258 pour visualiser l'ADN. Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM. Lobes antérieurs AF disséqués à partir de larves yw non infecté. Les échantillons ont été traités pour immunocoloration indirecte sans anticorps primaire (A et B) ou avec des anti-Spz anticorps (rouge; C, D, E, F) et de contraste avec Alexa Flour-phalloïdine à l'étiquette F-actine dans les cellules (vert;. B, D, F) lobes antérieurs GJ disséqués à partir de larves yw infecté et colorées avec des anticorps anti-Spz (rouge; G, H, I, J) et Alexa Fluor-phalloïdine (vert;. Les panneaux H, J) EF forts grossissements d'échantillons dans C et D, respectivement. grossissements IJ supérieur des échantillons dans G et H, respectivement. Barres d'échelle dans la MA panneaux, G, H représentent 50 um.

Figure 8
Figure 8. Les stades larvaires et la nymphe de L. heterotoma et L. boulardi. Les étapes individuelles ont été isolées à partir de la mouche après infestation larvaire ou nymphal hôtes, comme indiqué. Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'une étendue Zeiss Axio. Haut ligne AF L. stades heterotoma, 1-6 jours après l'infection. Bas de ligne AF postembryonnaire L. stades boulardi, 4 à 12 jours après l'infection.

figure-protocol-9 Figure 9. Diagramme du protocole expérimental.

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Discussion

L'intérêt pour les guêpes parasites de la drosophile est en pleine progression que les techniques moléculaires pour décoder les génomes entiers devenir efficace et rentable. Toutefois, par rapport à leurs exceptionnellement bien étudiés hôtes, de nombreux aspects fascinants de la biologie de guêpe restent obscures. Il s'agit notamment de questions liées à la gamme d'hôtes, la suppression immunitaire, superparasitisme, et le comportement. L'objectif de cette présentation était de démontrer les ef...

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Déclarations de divulgation

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants au professeur Todd Schlenke pour Trichopria drosophilae, le professeur Tony Ip pour les souches de mouches transgéniques, et le professeur Carl Hashimoto anti-Spätzle anticorps. Nous tenons à remercier les membres actuels et passés du laboratoire pour leurs contributions à cette présentation. Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes: des NIH (S06 GM08168, RISE 41399-009, et G12-RR03060), USDA (NRI / USDA CSREES 2006-03817 et 2009-35302-05277) et de la CFP-CUNY.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériels Type Entreprise Le numéro de catalogue
Matériel pour entretien de la culture des insectes
Levure Sèche active Fisher Scientific S802453
Fly alimentaire Farine de maïs, le sucre Recette standard
Miel Trèfle Néerlandaise d'or
Flacons Polypropylène flacons shell (étroit) Fisher Scientific AS514
Fermetures Vial Tampon de coton Fisher Scientific AS212
Fermetures Vial Buzz fiche Genesee scientifique AS273
Incubateur réfrigéré Précision 815 Thermo Scientific 3721
Matériaux pour la préparation des échantillons
Réservoir de CO 2 Os sec de qualité TW Smith UN1013
Spatule Spatule Micro (14 cm) Fisher Scientific 21-401-15
Plaques d'essai en Pyrex place 9-bien la plaque de dissection 85 mm X 100 mm Thomas scientifique 7812G17
Pasteur Pipettes La chaux sodée J & H Berge 71-5200-05
Forceps Style # 5 Sigma T-4662
L'éthanol 190 USP preuve Fisher Scientific 04-355-221
Formaldéhyde 37% p / p Fisher Scientific F79-1
Anticorps secondaire Cy3 AffiniPure d'âne anti-IgG de lapin (H + L) 01:50 excitation 546 nm; émission 565 nm Jackson Immuno Research Laboratories, Inc 711-165-152
Antifade (N-gallate de propyle) 4 ug / ml dans du glycérol 50% dans du PBS 1X MP Biomedicals 10274790
Glycérol Fisher Scientific G33-1
Hoechst 33258 0,2 pg / ml d'excitation 352 nm; émission 461 nm Molecular Probes H-1398
Rhodamine phalloïdine 200 unités / ml (6,6uM) d'excitation 540 nm; émission 565 nm Molecular Probes R415
Alexa Fluor 488 phalloïdine 300 unités / ml d'excitation 495 nm; émission 518 nm Molecular Probes A12379
Jetables
Pissette Fisherbrand Fisher Scientific 03-409-22A
Kimwipes Kimberly Clark Fisher Scientific 06-666A
Essuie-tout 1 pli pliage en C Penne 901-7CFTB2400
Microscopie  
Stéréomicroscope Leica MZFLIII Empire Imaging Systems, Inc 10446208
Stéréomicroscope Zeiss Stemi 1000 ou 2000 à C Carl Zeiss 000000-1006-126
Source lumineuse - LED Illuminateur col de cygne Fisher Scientific 12563501
Étape Transmis boîte à lumière avec plaque Carl Zeiss 455137000
Zeiss microscope confocal à balayage laser LSM 510 Carl Zeiss
Microscope composé Zeiss Axioplan 2 debout Carl Zeiss
Les souches Wasp Fly Filtrers
Leptopilina victoriae 16 yw
Leptopilina boulardi 17 1 UAS-GFP-dorsale 17
Leptopilina heterotoma 2 SerpentHemoGal4 13
Leptopilina heterotoma 14 1 MSNF9-moCherry 14
Trichopria drosophilae SS-GFP 15
Ganaspis xanthopoda 18 yw Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc 4
yw; Drosomycin-GFP/CyO y + 12

Références

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  2. Chiu, H., Morales, J., Govind, S. Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila. J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).
  3. Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade. Virus Res. 160, 159-165 (2011).
  4. Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae. PLoS Pathog. 6, e1001234(2010).
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